力学进展  2018 , 48 (0): 1811- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-011

Orginal Article

原子力显微镜力谱技术及其在微观生物力学领域的应用

葛林ɛ

NT-MDT中国分公司, 北京 100031

AFM force spectroscopy and its applications on micro biomechanics

GE Linɛ

NT-MDT, China office, Beijing 100031, China

中图分类号:  TH742, Q937

文献标识码:  A

通讯作者:  ɛ E-mail:ge@ntmdt-si.cnɛ E-mail:ge@ntmdt-si.cn

收稿日期: 2017-05-18

接受日期:  2017-09-1

网络出版日期:  2017-10-10

版权声明:  2018 中国力学学会 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

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摘要

基于原子力显微镜技术的力谱技术是一种高灵敏度的力学检测方法.它能够以前所未有的精度, 在微观生物力学领域表征组织、细胞、生物膜、蛋白质、核酸、功能材料等目标对象, 探索其包括形貌、化学信息、导电性、静电力以及生物学特性在内的等信息, 并且能够对其进行分子级别精度的三维操纵. 从而对分子结构与构象变化, 分子间的相互作用以及反应历程实现单分子水平的实时--原位观测, 提供了其他测试方法不能完成的实验设计之可能性.本文首先介绍了原子力显微镜及其力谱技术的原理, 以及影响测量结果的各个参数的物理意义; 其次按照单个目标对象与配对目标对象的区分方式, 详细介绍了力谱技术在微观生物力学各个尺度上的研究进展; 之后介绍了力谱技术结合成像模式下的发展和应用; 最后对设备的改进和本研究领域发展方向进行了展望.

关键词: 原子力显微镜 ; 生物力学 ; 分子力谱 ; 分子间相互作用

Abstract

Atomic force microscopy (AFM) based force spectroscopy is a high-sensitive mechanical detection method. With unprecedented accuracy, this method enables the characterization of a wide range of biological and synthetic bio-interfaces, ranging from tissues, cells, membranes, proteins, nucleic acids to functional materials. Besides the possibility of high resolution imaging of biological samples from the cellular level to the molecular level, AFM-based force spectroscopy allows their mechanical, chemical, conductive or electrostatic, and biological properties to be probed, and helps addressing fundamental challenges that cannot be addressed with other techniques. In this review, we summarize basic and advanced force spectroscopy approaches in micro biomechanics and evaluate their unique advantages and limitations.

Keywords: atomic force microscopy ; biomechanics ; molecular force spectroscopy ; intermolecular interactions

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葛林. 原子力显微镜力谱技术及其在微观生物力学领域的应用[J]. 力学进展, 2018, 48(0): 1811- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-011

GE Lin. AFM force spectroscopy and its applications on micro biomechanics[J]. Advances in Mechanics, 2018, 48(0): 1811- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-011

1 引言

生物力学是一门新兴交叉科学, 是生物物理学的重要组成部分, 它的基本任务是应用力学原理和方法对生物体中的力学问题进行定量研究.微观生物力学的主要研究内容是从分子及其相互作用角度研究各种动植物细胞、亚细胞结构以及它们的构成成分, 蛋白质和核酸等生物大分子的力学性质, 探讨发生在细胞内、细胞膜和核膜内, 以及核酸和蛋白质中的力学现象.以DNA、RNA、糖类及蛋白质等为代表的生物大分子具有重要的生物学功能, 它们在遗传、生长、发育、进化及病变等诸多重大生命活动中都发挥着不可替代的作用.生物分子间的相互作用是生物学过程的基础问题, 其推动着包括从细胞移动到DNA复制转录的几乎所有的生物运动. 与此同时, 分子间的相互作用又维持着生物体的稳定性, 如配体--受体相互作用、肽链折叠成稳定的三维结构, 都是生物分子间作用力抵抗随机热扰动以及其他外力作用的结果.生物学领域中几乎所有的物理、化学过程都与这些生物微观作用有关.力学性质是生物大分子最重要的性质之一, 与生物大分子的结构有着必然联系, 也是生物大分子发挥功能的前提.一些重要疾病的明显表象是某些生物分子的力学性质变化, 也有一些疾病就是由某些生物分子的力学性质变化引起的. 因此, 微观生物力学研究的开展, 有利于深入地理解生命过程, 更清楚地认识生命本质, 在学术和应用方面都具有非常重要的意义.

由Binnig, Quate和Gerber在1986年发明的原子力显微镜, 因具有很高的空间分辨率和力学灵敏度, 迅速在生物、物理、化学等诸多领域中得到了广泛的应用.原子力显微镜在生物样品的研究中具有明显优势------它可在空气、氮气等气体氛围下、真空中或各种近生理条件的溶剂体系中直接观测生物样品的表面形貌和结构特征; 样品制备相对简单, 无需进行染色、包埋等复杂处理过程, 并可用于表征不同柔软度的生物样品甚至活体细胞; 能够连续监测生化反应的动力学过程, 从而实现单分子的实时研究, 图像重复性很高.因此, 原子力显微镜已成为探测生物样品形貌的有力工具.

原子力显微镜的另一个重要功能, 是对生物样品间的各种相互作用力进行测量.这些各式作用力决定了两种目标样品的相互吸引或者排斥, 接近或者离开, 化学键的形成或者断裂, 生物分子立体构像的维持或者改变, 还同时支配着生物体内的各种生理现象、生化现象、药物药理现象, 包括离子通道的开放或关闭, 受体与配体的结合或脱离, 酶功能的激活或抑制等(白春礼等 2000).

基于原子力显微镜技术的力谱技术(force spectroscopy)是最近十几年间发展起来的高灵敏度检测方法, 它能以十几皮牛到几百纳牛的作用力, 对单个目标分子或细胞进行力学操纵和加工, 从而对分子结构与构象变化, 分子间的相互作用以及反应历程实现单分子水平的实时--原位观测(Cappella & Dietler 1999, Butt et al. 2005).该技术能够以很小的样品用量, 直接给出单分子的多重状态及其分布等情况, 而非统计平均信息. 近年来, 人们将原子力显微镜力谱技术应用于生物物理的研究中, 发展了许多具有开创性的方法, 涵盖了核酸与蛋白质的相互作用、酶与底物的相互作用、抗原和抗体间相互作用、受体和配体间相互作用、药物小分子和靶向中心的相互作用, 以及核酸、蛋白质、细胞和病毒等生物样品自身的力学性质研究.目前单分子力 学谱已经成为生物物理、高分子科学、表面科学和细胞分子生物学等领域不可或缺的一种重要的研究手段.

综上所述, 基于原子力显微镜的研究方法已经成长为强大的纳米尺度平台, 它能够以前所未有的精度表征包括组织、细胞、生物膜、蛋白质、核酸、功能材料等目标对象, 探索其包括形貌、化学信息、导电性、静电力以及生物学特性在内的信息, 并且能够对其进行分子级别精度的三维操纵.本文首先介绍了原子力显微镜及其力谱技术的原理, 以及影响测量结果的各个参数物理意义; 其次按照单个目标对象与配对目标对象的区分方式, 详细介绍了力谱技术在各个尺度上的研究进展; 之后介绍了力谱技术结合成像模式下的发展和应用; 最后对设备的改进和本研究领域发展方向进行了展望.

2 基于原子力显微镜的力谱技术

2.1 原子力显微镜的构造和工作原理

1986年, 为了观察绝缘材料表面的原子图像, IBM公司的Binning G和斯坦福大学的Quate C F, Gerber C合作, 发明了原子力显微镜(atomic force microscope, AFM) (Binnig et al. 1986). 当时, AFM的横向分辨率达到2 nm, 纵向分辨率达到0.1 nm, 放大倍数高达100万倍以上.由于其样品制备方法简单、能在接近生理环境的条件下(如溶液中)操作、对工作环境的要求比电镜的低得多, 因而立即得到了广泛的重视.

原子力显微镜是一种以检测探针与样品间相互作用为特征的扫描力显微镜, 其基本工作原理是: 能够感受到微弱作用力的弹性悬臂梁一端被固定, 另一端则有一微小的针尖, 当针尖对样品进行扫描时, 同距离有关的针尖--样品间相互作用力(既可能是吸引的, 也可能是排斥的)就会引起悬臂梁发生形变.由激光源发出的一束激光照射到悬臂梁的背面, 悬臂梁将激光束反射到一个光电检测器, 信号输入控制箱后经软硬件的控制和处理, 即可得到样品表面形貌或其他表面性质的信息.原子力显微镜不仅能反映测量体系的力学性质, 由于其具有独特的空间分辨率, 还能实时成像, 因而能提供更多的信息.

原子力显微镜的结构简图如图1所示.原子力显微镜的四大核心构件及其功能分别为: 为反馈光路提供光源的激光系统(laser); 进行力--距离反馈的悬臂梁系统(cantilever); 接收光反馈信号的光电探测器(photodiode); 执行 XY轴扫描和\(Z\)轴定位的压电扫描器(\(X\), \(Y\), \(Z\) piezo-scanner).

图1   原子力显微镜系统框图(Santosa et al. 2004)

   

下面简要介绍一下各个模块单元的属性.

(1)激光系统. 激光器发射一道激光至悬臂梁的背板, 作为光反馈通路的信号源.采用激光作为照射光源主要是出于稳定性和尺寸的考虑, 一方面激光光源的稳定性高, 可持续运行, 工作寿命长; 另一方面激光光源足够细、单色性好、发散程度弱, 可以很好地匹配悬臂梁末端的有限空间.常见的商业原子力显微镜激光光源可以根据实验条件配备, 从可见光至近红外波段都可以作为选择, 其强度一般在数毫瓦量级.

(2)悬臂梁. 悬臂梁的背板接收激光的照射, 并将其反射到光电探测器上.悬臂梁是原子力显微镜实验的核心耗材, 作为探测样品的直接工具, 它的属性直接关系到仪器的精度和使用范围. 悬臂梁的种类非常多, 在选择时需要根据实验需求考虑其配置. 一方面, 悬臂梁必须有足够高的力反应能力, 这就要求悬臂必须容易弯曲, 也易于复位, 通过选择合适的弹性系数, 可以测得小至皮牛(pN)级别、大至几百纳牛(nN)的作用力变化; 同时也要求悬臂有足够高的时间分辨能力, 因而要求悬臂的共振频率足够高, 可以追随表面高低起伏的变化.关于悬臂梁各个参数, 本文将在2.3.2节详细展开讨论. 整体来说, 商品化的悬臂梁尺寸一般在几十到几百微米之间, 其末端探针的曲率半径在1纳米至几十纳米之间, 其弹性系数在0.01牛每米至几百牛每米之间, 其固有振动频率在几千赫兹至几兆赫兹之间.

(3)光电探测器.目前的原子力显微镜探测悬臂微形变的主要方法是光束偏转法------用一束激光照在悬臂梁背板的末端, 而用位置灵敏光检测器(PSPD)来接收悬臂末端反射的激光束, 进而输出反映反射光照射位置的信号.由于悬臂的形变会引起反射光束的偏移, 导致反射光在PSPD上位置的变化, 进而产生反映悬臂的形变的电信号, 以供调节压电扫描器的伸缩控制.典型的光电探测器频响范围, 一般在数十兆赫兹量级.

(4)压电扫描器. 压电扫描器是由压电陶瓷材料制成的物理器件, 它能够将机械作用与电信号互相转换. 它不仅能够使样品在XY扫描平面内精确地移动, 也能灵敏地感受样品与探针间的相互作用, 同时亦能将反馈光路的电讯号转换成机械位移, 进而灵敏地控制样品和探针间的距离和作用力, 并记录因扫描位置的改变而引起的\(Z\)轴伸缩量之变化. 这样, 压电扫描器就实现了对样品表面的扫描.当针尖靠近样品表面进行水平扫描成像时, 针尖与样品间微弱的相互作用力引起悬臂梁发生形变, 使得通过悬臂梁背板反射到光电检测器的激光束发生偏转, 在恒力模式下反馈系统根据检测到的偏转位置变化不断调整针尖与样品的距离, 保持针尖--样品间的相互作用力恒定不变. 这样, 针尖随着样品表面的起伏而改变高度, 得到样品的表面形貌图像.要探测样品表面的精细结构, 除了高性能的悬臂梁以外, 压电扫描器的精确扫描和灵敏反应也是同样重要的. 常见的压电扫描器XY轴量程一般为几微米至几百微米, \(Z\)轴量程一般为几微米至几十微米, 数模转换精度为16位或18位. 图1中的压电扫描器位于样品下方带动样品移动, 此种配置一般称为样品扫描; 压电扫描器也可以位于悬臂梁的上方带动悬臂移动, 此种配置一般称为针尖扫描, 此时由于系统只带动针尖运动而不带动样品运动, 该配置可以不受样品重量的限制.

最早的原子力显微镜主要是作为观察样品表面形貌使用的.由于表面的高低起伏状态能够准确地以数值的形式获取, 它也作为检查表面粗糙度的测量仪器来使用. 随着设备的发展, 通过控制并检测针尖--样品之间的相互作用力, 原子力显微镜已经不仅可以以高分辨率表征样品表面形貌, 而且可以分析研究与作用力相对应的各种表面性质. 另外, 利用探针尖锐的针尖, 可以对样品进行精确地操纵和纳米加工, 从而使得原子力显微镜具有分辨率高、成本低、消耗低、工作范围广等一系列优点.目前已被大量应用于表面分析领域, 在纳米科学与技术中发挥着日益重要的作用, 为人类对微观世界的探索提供了理想的工具.

2.2 原子力显微镜力谱技术

2.2.1 原子力显微镜测力原理

图2展示了原子力显微镜的测力原理. 图2(a)中, 横坐标表示压电陶瓷的伸缩量, 其正值对应压电陶瓷收缩的方向, 即针尖远离样品. 纵坐标表示悬臂梁的弯曲量, 其正值对应悬臂梁弯曲程度变大. 在测力过程中, 力曲线首先按照黑色曲线依次经过\(a\), \(b\), \(c\)段, 之后沿红色曲线从\(c\)段返回至\(b\)点, 之后经\(d\)段回到基线. 首先, 样品随着压电陶瓷管的运动而与针尖逼近.在样品表面开始逼近悬臂梁而并没有接触到针尖的过程中, 如果悬臂没有受到长程的吸引(或排斥)力, 悬臂梁处于一种松弛状态, 光学检测信号不变. 压电陶瓷管的伸缩量信号被记录下来, 形成扫描基线, 即黑色曲线的\(a\)段. 随着探针逐渐逼近样品表面, 在\(b\)点处两者发生接触. 如果发生接触时针尖与样品在大气环境下, 其表面发生了水膜的融合, 那么黑色曲线在\(b\)点处会出现一个向下的弯折, 称为"snap-in". 如果接触时两者已经处于液相中, 则不会出现此现象.之后随着压电陶瓷的继续伸出, 黑色曲线进入\(c\)段, 即悬臂梁受力发生弯曲, 悬臂梁弯曲量信号增大.在两者作用力/压电陶瓷伸出量达到系统设定的最大值后, 逼近过程结束, 回退过程开始, 压电陶瓷开始收缩, 曲线开始进入红色区域.当针尖与样品分离时, 如果针尖没有捕捉到与任何目标样品或基底的相互作用, 那么红色曲线\(d\)段将与黑色曲线\(a\)段的基线重合.如果目标样品或者基底与针尖之间发生了相互作用, 那么此作用力会引起悬臂梁向下弯曲, 对针尖表现为吸引力、对样品表现为其受到拉伸, 如图中红线d段所示.最后, 当目标样品受进一步拉伸后, 两者相互作用会在桥联结构中较薄弱的部分发生脱落. 此时悬臂迅速复原, 表现在力曲线上为悬臂梁弯曲量迅速掉落回到基线.

图2   原子力显微镜测力原理. (a)"力--压电陶瓷"伸缩量曲线(以压电陶瓷位置为准);(b)"力--针尖样品距离"曲线(以样品--针尖距离为准). a \(\sim \) d"逼近--回退"循环过程中的各个阶段; (c)样品--针尖距离与压电陶瓷位置的相互关系(Baltrukovich 2008)

   

一般来说力曲线的红色部分, 即回退曲线, 是数据分析过程中的重点研究对象, 因为其反映了针尖样品接触之后的两者相互作用, 带有丰富的信息.该部分可以给出关于分子间相互作用的很多信息, 以及样品从针尖或基底上脱落时所需力的大小或者对应着特异性相互作用的结合强度.力曲线几乎包括了所有关于样品和针尖间相互作用的必要信息.

如果样品足够坚硬, 作用力将随着压电陶瓷管的向上运动而迅速增大, 即\(\alpha\)倾角值很大, 转折角非常锐利; 如果样品比较柔软, 作用力将随着压电陶瓷管的向上运动而缓慢增大, 即\(\alpha \)倾角值较小, 转折角形成一个弧形转折区.当悬臂梁施加在样品上的作用力完全不会使样品发生形变(或者样品形变可忽略不计)时, 悬臂梁弯曲量即为压电陶瓷管移动距离, 图2(a)中的\(\alpha\)倾角最大、\(c\)段斜率最大, 此时c段斜率称为悬臂梁光学灵敏度(inverted optical sensitivity, 又称deflection sensitivity), 其定义为激光偏转量除以悬臂梁弯曲量, 单位为光强/nm. 为了获得这一关键参数, 需要在硅片、玻璃等坚硬基底上先进行一次力曲线实验.

例如图2(a)所示的力曲线, 其横坐标为压电陶瓷管伸缩量, 其伸缩量对应图2(c)的\(z_{\rm p}\)部分. 当针尖拉伸样品时, 由于相互作用力, 样品也会拉伸针尖导致悬臂梁弯曲, 其弯曲量对应图2(c)中的\(\Delta x\)部分. 于是此时的针尖--样品间的距离, 对应图2(c)中的\(d_{\rm ts}\), 即为上述两者之差, 如下式所示\[d_{\rm ts}=z_{\rm p}-\Delta x\ \ (1)\]由于施加在悬臂梁上的力\(F\)可以表示为悬臂梁弹性系数乘以悬臂梁弯曲量, 根据胡克定律, 有\[F=k\times \Delta x\ \ (2)\]其中\(k\)为悬臂梁的悬臂梁弹性系数, 单位为N/m.

于是通过上述两个关键参数------悬臂梁弹性系数以及悬臂梁光学灵敏度, 我们可以对力曲线进行校准, 将力曲线的纵坐标转换为以牛顿为单位的作用力值, 同时还可以将力曲线的横坐标转换为针尖--样品间的距离, 所得结果如图2(b)所示. 如图2(a)所示的以压电陶瓷伸缩量为横坐标的力曲线, 一般称之为\(F\)-\(Z\)曲线; 如图2(b)所示的以针尖样品间距离为横坐标的力曲线, 一般称之为\(F\)-\(D\)曲线. 在绝大多数文献中, 如果没有进行特殊说明, 都是采用的校准后的\(F\)-\(D\)曲线, 同时将力曲线的纵轴翻转, 以便使得相互作用力的值可以用正值表示(Hugel et al. 2002).

2.2.2 力曲线拟合模型

原子力显微镜的力谱技术是对力曲线进行深入分析而得到关于目标本身拉伸特性或与其他物质作用力特性的一种力学分析方法.一般分为针对细胞等大尺寸样品的力谱研究, 以及分子级别小尺寸的单分子力谱研究两大类. 在细胞级别的大尺寸样品研究中, 可以直接使用各种力学模型分析其硬度、黏弹性等力学性质, 这些模型将在3.3节中详细介绍. 在分子级别的小尺寸样品研究中, 利用如虫链模型、自由连接链模型以及自由旋转链模型等物理模型, 对拉伸力曲线进行拟合分析, 可得到目标分子本身拉伸的生物物理学性质; 对拉伸力曲线中的断裂峰进行分析, 得到相应的解离力, 从而得到生物大分子对之间的特异性相互作用信息.单分子力谱有助于获得包括DNA、蛋白质和多糖在内的单分子的纳米级物理化学性质(Janshoff et al.2000). 有两种模型经常被应用于对此类力曲线的拟合, 他们分别是自由连接链模型和虫链模型.

自由连接链模型(freely-jointed-chain, FJC) (Smith et al. 1992)又称自由结合链或无规飞行链.此模型是高分子链模型的一种理想化的简单模型. 该模型假定: 高分子是由足够多的不占有体积的化学键所组成, 这些键的取向不受键角和相邻键旋转角的限制, 在三维空间的任何方向上的取向几率是等同的. 其均方末端距\(R^{2}=Nb^{2}\) \((b\)为键长, \(N\)为键数).该模型中多肽链的延展长度\(x\)与外部施加的作用力之间满足以下等式\[F(x) = L\cdot \left[ {\coth \left( {\dfrac{Fl_K }{k_{\rm B} T}}\right) - \dfrac{k_{\rm B} T}{Fl_K }} \right] \ \ (3)\]其中\(L\)表示多肽链的轮廓长度.自由连接链模型及其改进模型能够很好描述包括多糖和右旋糖苷(dextran)等在内的聚糖所得的力曲线数据(Marszalek et al.1998, Rief et al. 1997a).

虫链模型(worm-like-chain, WLC) (Bustamante et al. 1994), 又称蠕虫状链模型, 是由\(n\)个长度为\(b\)的、键角为\(\pi -\alpha\)并可进行自由旋转的想像键组成的链状分子, 在保持其轮廓长度\(L\)及持久长度\(l_{\rm p}\)不变的条件下, 使想像键的数目\(n\)趋近于无穷、键角\(\pi -\alpha \)趋近于\(\pi\)时所得到的一种极限状况的模型链. 它是一种适用于研究的分子链, 尤其是聚合物链和刚性分子链构象的简化模型链.要注意的是想像键不是真实键, 键数、键长和键角都与真实分子链的实际参数无关.该模型中多肽链的延展长度\(x\)与外部施加的作用力之间满足以下等式\[F(x) = \dfrac{k_{\rm B} T}{l_{\rm p} }\cdot \left[{\dfrac{1}{4}\left( {1 - \dfrac{x}{L}} \right)^{ - 2} +\dfrac{x}{L} - \dfrac{1}{4}} \right] \ \ (4)\] 式中, \(F(x)\)为所施加的作用力, \(L\)为肽链的伸直长度, \(l_{\rm p}\)为肽链的持久长度, 通常取值0.4 nm (Oesterhelt et al. 2000), \(x\)为伸长量, \(k_{\rm B}\)为玻尔兹曼常数, \(T\)为绝对温度.根据各个突变峰WLC 拟合的伸直长度计算得到该部分所含氨基酸的个数, 以此来得到膜蛋白的去折叠路径信息.此模型已经被成功应用于拟合DNA和蛋白质分子拉伸所得到的力曲线(Bustamante et al.1994).

以上两种模型模拟的多肽链示意图如图3所示.

图3   自由连接链模型和虫链模型对多肽链的拟合(Janshoff et al. 2000). FJC为自由连接链模型, 键长\(l\) 固定, 键角\(\theta \)任意, 键在任何方向上取向几率相等; WLC为虫链模型, 是具有恒定弯曲弹性且无微观结构的半柔性均质线链

   

力谱技术为表征生物系统的机械特性提供了有力的工具, 但是理论推导和实验结果均表明, 这些系统的机械响应是取决于施加力的加载速率(loading rate) (Janmey et al.2007, Hinterdorfer & Dufrêne 2006).加载速率是指施加于被测物体的作用力随时间的变化率, 以某一恒定速率拉回探针时测定的分子间解离力, 只是一个连续的分子间作用力谱中的一个点.由于系统的机械响应与作用力的加载速率是非线性关系, 并且随着生物系统的不同而变化, 因此不建议仅以单一的加载速率进行力谱实验.为了更好地了解生物系统的机械性能, 一般需要在较宽范围的加载速率下对该响应进行表征(Krieg et al. 2014, Medalsy & Müller 2013, Herruzo et al. 2014).

测量断键力随外力加载速率的变化, 便可获得动力学力谱(dynamic force spectroscopy), 并计算出在不施加外力的平衡态条件下的复合物解离速率常数\(k_{\rm off}(0)\)、平均寿命\(t_{0}\)、活化态到结合态的距离\(x_{\rm u}\)等动力学参数, 以及复合物在解离过程中要跨越几个势垒, 是否存在复合物解离的中间体等(Lee et al. 2007, Strunz et al. 2000).单分子力谱是单分子水平研究生物分子复合物解离途径和解离动力学过程的有效方法.根据Bell-Evans模型, 施加复合物的断键方向上的力会减小复合物解离的活化能, 增大其解离速率常数, 单对分子复合物的断键力\(F\)与ln\(r\)\((r\)为外力加载速率)之间存在线性关系(Bell 1978, Evans & Ritchie 1997). 此外, 单分子力谱也可用来估计针尖上的配体与基底上受体之间的结合速率常数\(k_{\rm on}\)(Baumgartner et al. 2000).测量不同作用力下单分子相互作用的寿命, 就可获得势垒的位置与高度, 结合平衡态的热力学研究, 就可较完整地描绘出能量形貌图(Merkel et al. 1999).

以蛋白质为例的样品, 在外力下典型的能量形貌图如图4所示.其中图4(a)描绘了含有天然态(natural, N)和去折叠态(unfold, U)两种形态的蛋白质在外力下去折叠的能量形貌图(黑色实线).此二状态之间有着高度为\(\Delta G _{0}^\ddag\) 的能量势垒, 此外图中还包括了不施加外力平衡态条件下的复合物解离速率常数\(k_{\rm off}\)(0)、平均寿命\(t_{0}\)、活化态到结合态的距离\(x_{\rm u}\)等动力学参数. 而后在外力作用下, 其能量势垒得到了降低, 能量形貌图及其各个参数发生了改变(红色实线). 图4(b)描述了含有天然态(N)、中间态(intermediate, I)和去折叠态(U)三种形态的蛋白质在外力下去折叠的能量形貌图(黑色实线), 其过程与图4(a)类似, 在\(F\) vs. ln\(r\)曲线上分为两个线段.

图4   样品在外力下典型的能量形貌图.(a)含有两态的蛋白质能量形貌图, (b)含有三态的蛋白质能量形貌图(Bippes 2010)

   

2.3 影响力曲线的各个因素

2.3.1 样品的载体及其固定

由于在原子力显微镜实验中, 需要对样品进行固定, 因此固定样品的载体(也称基底)对于能否得到理想的结果是至关重要的.一个理想的基底应具有以下特点: 在实验室环境下具有化学稳定性、容易制备、相对便宜、能简便的进行修饰并且能长时间保存.对于许多分析而言, 理想的基底应包括较大范围的相当平整的区域, 这一点是相当重要的. 原子力显微镜的成像载体种类比较多, 根据研究工作对成像载体表面粗糙度及其他表面特性的要求, 可选择云母片、硅片、玻璃、金膜、生物膜、石墨等作为基底, 其中最常用的是云母. 云母是一种表面平整的基底, 几平方微米范围内的表面粗糙度只有几埃, 且具有化学惰性, 吸附能力强, 价格便宜, 容易剥离得到新鲜洁净的表面, 且可以进行化学修饰.云母的这些优点决定了它是一种理想的基底, 能用于许多物质的成像.从DNA到活细胞的成像都能采用云母作为基底. 样品与云母的结合与否, 取决于静电排斥力和范德华力的共同作用, 静电力取决于样品和基底的表面电荷及缓冲液中的电解质.电解质的性质和浓度决定着样品的吸附. 因此, 根据样品和基底的表面电荷调整缓冲液中的离子浓度, 是样品成功吸附的关键. 尽管DNA本身呈现负电性不易吸附到云母片上, 但是可以通过利用二价阳离子(如Mg\(^{2 + }\)或Ni\(^{2 +})\)处理云母表面, 或者直接将二价阳离子加入到缓冲液中(Hernandez-Ramon et al. 2008).如果担心二价离子的引入干扰实验设计, 还可以尝试采用氨基硅烷化试剂处理云母表面, 产生正电性的表面(Lyubchenko et al. 2013).目前常用的基底还包括硅片和金表面等, 通过特定的样品制备技术, 生物分子能与它们牢固结合, 甚至形成共价交联. 虽然金膜较云母贵, 但它易于与疏基化合物形成牢固的Au---S共价键合.通过对其末端基团进行修饰、控制, 可以得到不同性质的表面(Hinterdorfer & Dufrêne 2006).由于这种固定方法主要是利用结合比较强的Au---S键, 所以固定效果好, 无论在大气还是在液体中成像或进行力曲线测定都可以.

2.3.2 悬臂梁的选取及探针功能化

因为在使用原子力显微镜对样品成像时, 所得结果是样品形貌与针尖形状的卷积结果, 所以悬臂梁是原子力显微镜实验的核心配件. 悬臂梁的相关参数主要包括以下几个.

悬臂梁的材料. 典型的悬臂梁是由硅(Si)或氮化硅(Si\(_{3}\)N\(_{4})\)制作的, 其中硅探针一般比较坚硬, 适合制作相对短小、振动频率高、弹性系数比较大的悬臂梁; 氮化硅相对比较柔软, 适合制作相对长的悬臂梁, 弹性系数较小.

悬臂梁的尺寸. 如图5(a)所示, 典型悬臂梁的长度在几十微米至几百微米之间, 厚度一般为几微米, 宽度一般为几十微米.该尺寸直接决定了悬臂梁共振频率的高低以及弹性系数的大小.

悬臂梁背板的反光镀层. 悬臂梁没有针尖的一侧称为背板, 是激光照射的位置.一般情况下在这里会镀上一层金、铝、铜等金属层, 用于增加反光性.由于裸硅在红光及近红外波段具有一定的透光性, 其上下表面反射的激光会有干涉.所以没有反光镀层的悬臂梁除了激光信号弱之外, 还会在力曲线实验时产生有波浪形状的基线.悬臂梁的形状和个数. 如图5(a)和图5(b)所示, 悬臂梁的形状一般有长方形和V字形两种, 又称一字梁和三角梁.其中长方形的悬臂梁力学模型更为简单, 同时能够比较容易地扭转, 适合测量摩擦力等相互作用力; 三角形的悬臂梁可以更好地控制形变使其保持在法向方向, 同时工艺上更容易制造出指定弹性系数的悬臂.

悬臂梁的弹性系数. 此参数为力谱实验的重要参数, 它直接决定了悬臂梁的测力精度和所能施加的作用力大小.典型的悬臂梁弹性系数在0.01 N/m到500 N/m之间, 需要根据实验要求选择合适的悬臂梁.

悬臂梁的共振频率. 依据原子力显微镜的成像模式, 需选择具备适当共振频率的悬臂梁. 一般地, 采用接触模式的悬臂梁共振频率较低, 在几万赫兹范围; 轻敲模式的悬臂梁共振频率较高, 在十万赫兹量级.

针尖的曲率半径. 如图5(c)所示, 一根全新的探针拥有尖锐的针尖, 市面常见的探针末端曲率半径可以达到1 \(\sim \) 10 nm, 越尖锐的的针尖在对扫描图像的卷积中贡献越小, 从而更接近样品的真实形貌. 如图5(d)所示, 探针是容易受损和被污染的. 当极细的探针尖端被损坏时, 原子力显微镜的分辨率会大幅度下降, 就无法获得样品的超精细结构图像; 此外在扫描时由于探针与样品间的作用力, 样品成分有可能黏在探针针尖上, 从而使针尖变粗或出现多个探针的现象, 扫描时可能会出现许多假象.

图5   各样式的悬臂梁.样品在外力下典型的能量形貌图(Kopycinska-Müller et al. 2006).(a)一根典型的长方形悬臂梁, 载有高深宽比的尖锐探针; (b)一根V字形悬臂梁 (截取自NT-MDT公司、MicroMash公司探针网页); (c)全新的尖锐探针针尖; (d)磨损后的探针针尖

   

针尖的镀层和样式. 在一些特殊的实验模式下, 需要针尖末端带有相应的镀层, 例如具备铂、金等导电层的探针可以进行导电性或静电力的相关实验; 具备镍、钴等磁性镀层的探针可以进行磁畴分布等相关测量; 还有一些力学实验中使用已知形状的小球、楔形物、甚至直接使用无针尖悬臂梁本身等物体取代针尖, 进行相应的力学测试.

在原子力显微镜力谱实验中, 许多情况下需要对探针针尖进行适当的化学修饰, 以实现探针功能化.探针功能化是指通过化学或生物方法将各种生物分子固定在探针上.目标分子的固定方法, 在沈家骢(2004)的著作中已经进行了详细的介绍, 主要分为物理吸附以及化学键合两大类.基于物理吸附的制样方法最为简便, 只需依赖待测分子与基底或针尖之间较强的黏附力即可形成样品层; 当物理吸附相互作用比较弱时, 可以采用共价键将单个样品修饰于针尖或者基底, 或将配对样品分别修饰于针尖及基底, 从而测量特异性相互作用.探针功能化使原子力显微镜在力学测定功能之上又具备了分子识别能力, 成为探测生物分子相互作用的有力工具.早期的探针功能化是利用牛血清(bovine serum albumin, BSA)的非特异性物理吸附作用将生物分子连接到探针上(Hinterdorfer & Dufrêne 2006, Dupres et al. 2007). 但是, 这种探针功能化方法常出现多位点连接、多键同时断裂带来的数据分析困难, 同时也不能测定较强分子间作用力.于是发展出了以线性分子为连接体(cross-linker)将生物分子连接于探针上的功能化手段------桥连法, 其最大的优点是使连接的生物分子具有更大的自由度, 为分子识别提供了良好的作用空间, 特别适合于研究空间结构专一性高的分子识别事件. 其次, 通过稀释连接体分子或控制探针表面修饰基团的密度可降低连接体分子在探针表面的密度, 确保探针分子与待测分子发生单分子识别. 最后, 利用连接体可实现蛋白质定向连接, 暴露探针分子的特定基团, 提高单分子识别的准确性, 减少非特异性作用的干扰.

此方法的一般步骤是将一个可伸缩的线性分子连接于探针, 再将需固定的分子连接于线性分子, 这种方法使被连接的分子具有一定的空间自由度(Chtcheglova et al. 2007). 针尖化学修饰的方法有多种, 其中比较常用的修饰方法是商品化的硅或氮化硅探针经化学处理, 如食人鱼洗液(98% H\(_{2}\)SO\(_{4}\):30%H\(_{2}\)O\(_{2}\)体积比7:3)清洗, 使其表面暴露出大量硅羟基(---SiOH), 再对探针表面硅羟基进一步硅烷化、醚化或氢硅化等, 或者直接将镀金针尖进行巯基化处理. 其中, 探针的硅烷化基于探针表面活化的硅羟基与硅烷化试剂反应, 如3 -氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)、3 -氨基丙基二甲基甲氧硅烷(3-aminopropyldimethylmethoxysilane, APS)等, 在针尖表面形成含有所需化学基团的有机单分子层(Xue et al. 2014).探针的醚化是利用醇类(通常是乙醇胺)与探针表面活化的羟基(---OH)反应, 形成末端含有氨基(---NH\(_{2})\)的有机单分子层(Wildling et al. 2011).在探针的氢硅化中, 首先对探针表面用1%的氢氟酸(HF)处理形成氢化的硅表面, 然后利用氢化表面与烯烃加成反应, 通过Si---C共价键将有机分子连接到针尖表面(Buriak 2002).镀金层探针的化学修饰方法, 是镀金探针表面与烷硫醇的巯基通过金硫键之间的强非特异性相互作用, 形成稳定的自组装单分子层(Wang et al. 2004).

经上述处理后的探针进一步与交联剂连接, 最终可以将具有或修饰上对应基团的生物大分子连接到探针表面.目前最常用的交联剂是聚乙二醇(PEG)衍生物, 它们一般具有不同的功能末端. 例如, 一个具氨基反应活性的N-羟基琥珀酰胺(N-hydroxy succinimide, NHS)末端和一个能与硫醇共价结合的2 -吡啶二硫基丙基或乙烯基砜末端.在进行探针功能化时, 连接体的氨基反应活性末端与探针表面的氨基末端连接, 而具有硫醇反应活性的另一端与蛋白质或其他生物分子的巯基通过二硫键相连(Hinterdorfer & Dufrêne 2006). 当目标蛋白质没有巯基时, 需要对其进行处理以产生巯基, 常用的处理试剂为SATP (Ebner et al. 2007).

在配体分子与针尖之间插入PEG长链分子具有很多优点, 如配体分子可以自由定位, 可避免探针与样品接触时针尖对配体分子的挤压, 以及能根据PEG分子柔软非弹性的特点来从力曲线上辨别特异性分子结合和非特异性分子结合等(Barattin & Voyer 2008, Carvalho & Santos 2012). 此外, 由于PEG分子与针尖及配体分子均为共价键结合, 结合强度远大于受体--配体之间的结合力, 因而在探针拉力作用下受体--配体化学键将会首先断裂, 从而可确保测量得到的力为受体--配体间的结合力.为了测量单对受体--配体分子结合力, 需要控制修饰到针尖表面的配体分子密度足够低, 例如可根据针尖尺寸并对配体分子进行荧光标记来估算针尖接触区域内的配体分子数目(Hinterdorfer et al.1996), 以确保针尖与细胞接触面积内只发生单对分子结合.

2.3.3 设备的硬件限制

利用原子力显微镜进行相互作用力的测量, 可以分辨的最小的相互作用力受到系统噪声的限制. 通过对噪声的分析, 我们可以估算出力曲线中能够得到的作用力的分辨率.原子力显微镜的噪声与悬臂的热振动、扫描管的垂直方向分辨率、激光探测系统的噪声等有关, Skulason 等(2002)对此做了详细的分析.

首先是针尖的热振动噪声, 其大小与温度有关. 根据量子力学的基本原理, 热振动的能量最小单位应该是\(K_{\rm B}T/2\), 其中\(K_{\rm B}\)为Boltzman常数(1.3807 \(\times \) 10\(^{ - 23}\) J/K), \(T\)为绝对温度. 所以有 \[ \dfrac{k \langle Z^2 \rangle }{2} =\dfrac{K_{\rm B} T}{2} \ \ (5)\]其中, \(k\)为悬臂弹性常数, \(Z\)为悬臂在垂直方向的振幅.从而可以得到由此导致的力的噪声为\[ F _{\rm thermal} = k \langle Z\rangle = \sqrt {k\cdot k\cdot\langle Z^2 \rangle} = \sqrt {k\cdot K_{\rm B} \cdot T} \ \ (6)\]对于一个弹性系数\(k\)为0.1 N/m的悬臂, 在300 K的温度下, \(F_{\rm thermal}\)的大小约为20 pN. 这是对系统噪声的一个最根本的物理限制, 与仪器系统无关. 实际上悬臂热振动的噪声还跟悬臂的形状有关, 悬臂越长, 噪声越大. 在获取悬臂的弹性系数时, 一般较硬的长方形悬臂梁可以采用Sader方法(Sader 2002, Sader et al. 1999), 而三角形或者非常柔软的悬臂梁, 一般采用热噪声(thermal tune)的方法 (Saulson 1990) .

悬臂的偏转是通过反射激光点在光电接收器上的位置改变来探测的.根据光杠杆原理, 悬臂微小的偏转被放大几千倍反映在光电接收器上, 再通过一个12位的模数转换器转换为vertical deflection值, 它的范围为\(\pm 10\) V, 对于悬臂的偏转约为100 nm.所以由此导致的误差为100 nm/(2\(^{12})=0.024\) nm.对于一个弹性系数为0.1 N/m的悬臂, 引起的力的误差约为2.4 pN.

在力曲线的测量过程中, 样品垂直方向的移动是由压电陶瓷做成的扫描管来带动的.压电陶瓷本身的精确度非常高, 但是它是由一个16位或18位的数模转换器变换后由 \(\pm\) 220 V或 \(\pm \) 300 V的电压驱动, 其精确度受数模转换器的限制.例如对于NT-MDT原子力显微镜使用的大量程扫描管, 它在垂直方向上的最大移动范围约为25 \(\mu \)m, 采用18位数模转换器.那么由此导致的精确度为25 \(\mu \)m/(2\(^{18})=81.24\) pm.这样对于一个弹性系数为0.1 N/m的悬臂, 引起的力的误差约为8.12 pN.在实验过程中要减小这一项误差引起的噪声, 应减小扫描管在垂直方向的移动距离(\(Z\) limit值).

与此同时, 由于压电材料的蠕变(creep)、迟滞(hysteresis)以及非线性(nonlinearity)等不完美属性, 应该在力曲线模式中也引入闭环控制.闭环控制是应用输出与输入信号之差来作用于控制器, 可减少系统误差, 而开环系统没有此功能. 闭环与开环的主要区别在于, 闭环控制有反馈环节, 通过反馈系统使系统的精确度提高, 响应时间缩短, 适合于对系统的响应时间、稳定性要求高的系统. 开环控制没有反馈环节, 系统的稳定性不高, 响应时间相对来说很长, 精确度不高, 适用于对系统稳定性精确度要求不高的简单的系统.

从上面的分析可以看出, 为了减小测得的相互作用力的噪声, 提高分辨率, 应该使用弹性系数小的悬臂. 理想的原子力显微镜针尖应具有以下特性: ①较低的力学弹性系数, 使得很小的力就能产生可观测的位移; ② 较高的力学共振频率; ③ 高的横向刚性, 针尖与样品表面的摩擦不会使它发生弯曲; ④悬臂梁长度尽可能短; ⑤悬臂梁带有能够通过光学、电容或隧道电流方法检测其动态位移的反射面或电极; ⑥针尖尽可能尖锐, 曲率半径尽可能小. 必须指出的是, 上述几项仅仅是为了减小针尖导致的力信号噪声时考虑的因素, 在实际的实验构架中, 针尖的选择往往受到各种依实验目的而决定的各种限制, 届时很可能必须以牺牲力学分辨率为代价而去满足实验要求.

3 力谱技术研究单个目标对象的应用

原子力显微镜力谱模式, 可以作为一个探测纳米力学性质的多功能平台, 提取生物系统的定量参数, 包括来自组织、细胞、蛋白质、核酸, 以及非生物系统如功能化表面或基质的定量参数. 在基于原子力显微镜的力谱测试中, 将悬臂梁探针趋近到样品上按压后缩回, 同时记录悬臂梁的偏转量和压电陶瓷扫描管伸缩的距离, 经校正后生成力--距离曲线.

自原子力显微镜的早期应用以来, 力--距离曲线就已经被用于测量界面的机械性能, 并量化地测量范德华相互作用、疏水和亲水的性质, 以及离子层电荷和静电双层相互作用力等(Frisbie et al. 1994, Ducker et al. 1991). 在进针过程中, 原子力显微镜的探针与样品在指定位置相互作用, 直到达到指定的最大压力或者指定的最大位移. 力曲线趋近曲线部分的分析, 特别是描述压痕的区域, 可以定量的描述样品的变形、弹性和能量耗散的性质.力曲线回退曲线部分的分析, 能够描述探针与样品之间的黏附力.作用在探针和样品上的分子间、和分子内作用力, 一般取决于它们的物理化学性质和缓冲溶液(Butt et al. 2005).

生物样品的力学性质既受单个高分子链弹性的影响, 又受高分子链间相互作用的影响.利用传统的研究方法, 一般只能给出样品宏观尺度的力学性质信息, 很难从这些复杂的信息中提取出某一个因素对样品力学性质的影响.尽管物理学家们通过理论计算的方法可以描述这种单个链或键的行为, 但缺乏实验数据的支持. 因此, 研究单个目标样品的结构与功能及其动态行为, 将隐藏在平均效应中的重要信息提取出来变得举足轻重. 近年来, 随着原子力显微镜力谱技术的发展, 可在纳米尺度进行精确操作与测量的单分子技术应运而生. 在接下来的章节中, 将介绍力谱技术对单个目标对象进行的研究应用, 研究对象的尺度覆盖了从核酸、小分子, 到细胞的微观生物力学领域.

3.1 核酸及小分子

DNA分子是遗传信息的载体, 能够指导生物的发育与维持生命机能的正常运作. 1953年, Watson和Crick提出了著名的DNA双螺旋结构模型.DNA分子的空间结构确保了遗传信息的稳定存在及准确传递(例如复制与转录).而在遗传信息的传递过程中, DNA会受到拉伸、压缩等各种外力的作用而发生形变, 因此双螺旋DNA的力学稳定性研究对于认识DNA复制等重要的生物学过程具有重要意义.单分子力谱的方法可以有效地用于这种相互作用的研究, 具有比其他研究方法更为直观和直接的优势.

在互补核酸链的两端施加外力而导致DNA双螺旋结构分离成两个单链的过程, 称为外力诱导DNA熔融.Rief等(1999)基于AFM的单分子力谱研究了DNA双螺旋的拉伸行为, 揭示了该结构的力学性质.实验过程中DNA双螺旋链片段固定在探针与基底之间, 然后往复拉伸, 如图6(a)所示的典型力曲线. 由于实验中所用的DNA分子链较长, 因此, 在未受到外力拉伸时, DNA分子以无规线团形式存在.在施加外力进行拉伸的初期, DNA分子由无规线团的卷曲状态转变为伸展状态, 体现在力曲线上为类似水平基线的信号.当达到完全伸展长度以后进一步拉伸时, 力曲线上大于65 pN的高力值区域的信号对应DNA分子的弹性, 此时DNA的构象由天然的B-DNA转变为过度拉伸的状态(简称B-OS转变).在此过程中, DNA的长度显著增加, 达到其完全伸展长度的1.5 \(\sim\) 2.0倍, 而作用力值大小基本不变, 在力曲线上表现为一个力值为65 pN的长平台. 在往复拉伸过程中, 当拉伸的力值不超过65 pN时, 松弛曲线可以很好地与拉伸曲线重合, 不出现滞后现象. 研究发现, 这个平台的高度不受拉伸速率的影响. 因此, 该转变是一个可逆平衡过程. 后续的研究发现, 这个平台的高度不仅不受拉伸速率的影响, 也不受针尖与DNA结合位置的影响(Paik & Perkins 2011), 于是推测双链DNA 在65 pN外力作用下发生了部分熔融解链.随着进一步的拉伸, 双链DNA发生进一步的熔融转变并最终完全转化为单链DNA, 对应力曲线中的较高力值的短平台. 该平台具有速率依赖性, 随着拉伸速率的增大而增大; 在往复拉伸过程中, 随着在该区域停留时间的延长, 松弛曲线与拉伸曲线之间的滞后现象也显著增加. 因此, 该转变是一个非平衡过程.发生滞后现象的松弛曲线与单链DNA的拉伸曲线极其相似, 进一步证明, 在熔融转变之后, 双链DNA转变成了单链DNA.

图6   原子力显微镜力谱技术作用于核酸的各类实验设计. (a)外力诱导下的DNA双螺旋熔融(Krautbauer et al. 2002b), (b)单链DNA与表面的摩擦力测试(Kühner et al. 2006), (c)将RNA链从病毒中直接提取的力学实验(Liu et al. 2010b), (d)外力诱导的DNA双螺旋熔融, 及其在SSB蛋白辅助下的复原(Liu et al. 2010a)

   

DNA的力曲线具有指纹特征, 只要是双螺旋DNA在拉伸条件下都会存在B-OS 转变平台.而许多DNA结合分子与DNA作用后会引起该转变区域指纹谱的变化, 因此该指纹谱是研究DNA结合试剂(如蛋白质和药物)与DNA相互作用的指示标志(Krautbauer et al.2002b, Krautbauer et al. 2000).原子力显微镜力谱实验中, 探针相对于样品的移动可以不限于在同一点的位置上仅沿\(Z\)轴上下移动, 在系统程序设定的路径下其活动范围可以是整个三维空间. 图6(b)描述了力谱技术用于研究不同聚合物样品(单链DNA, 聚烯丙胺)与云母表面的摩擦力测试(Kühner et al. 2006). 在实验过程中, 探针末端按照指定的路线接近或远离基底表面, 聚合物样品将表现出与表面解离或在表面滑动的现象, 也有可能同时发生这两种现象.于是此时获得的力谱信息, 将能够得到在设定的实验条件下聚合物链样品的摩擦力强弱的信息. 该研究表明, 即便两种聚合物链样品与同一表面具有类似大小的结合力, 它们与表面的摩擦力所反映的面内移动能力的差异仍然有可能具有十分显著的差异.

除了DNA之外, RNA也可以作为原子力显微镜力谱实验的研究对象. 在图6(c)中, 实验者在单分子层面上直接研究了烟草花叶病毒(TMV)RNA与其蛋白质外壳之间的相互作用, 在实验中成功的将遗传RNA从其蛋白质外壳形成的螺旋形槽中提拉了出来(Liu et al.2010b, 2013).实验研究了提拉速度与环境酸碱度pH值对RNA与蛋白质外壳相互作用的影响.动态力谱数据显示pH值为 4.7时, RNA与外壳蛋白质的脱离过程只经过一个主要的能量势垒; 而pH值为7.0时, 该过程开始显现第二个能量势垒, 出现在更远距离的能量势垒主要归因于TMV内通道内无序环的阻碍.此外还讨论了分离出来的RNA与蛋白质外壳的重新结合问题, 并讨论了这些蛋白质环的生物学功能.

在研究DNA双螺旋链熔融过程中, 还可以引入其他的生物分子, 如图6(d)中所示, 在缓冲液中加入了与单链DNA(ssDNA)特异性结合的单链DNA结合蛋白(SSB) (Liu et al. 2010a).在本实验中, 引入了枯草芽孢杆菌SSB蛋白, 实验结果证明当双链DNA延伸超过其轮廓长度时, 会被部分融化, 产生可被SSB蛋白捕获的一些单链DNA片段.实验还系统地研究了拉伸长度、等待时间和盐浓度对双链DNA和SSB-ssDNA相互作用的构象转变的影响.此外, 研究了DNA嵌入剂普罗黄素(proflavine)与双链DNA的结合.当双链DNA与过量普罗黄素结合后, 其力学稳定性会有大幅度提高, 即使在150 pN的作用力下也没有观察到熔融现象的发生, 双链DNA不再断裂成单链DNA, 并且没有检测到SSB-DNA的相互作用.

生物大分子在生理条件下(酸碱度近中性的室温稀盐水溶液)往往会形成规整、精确的超分子结构, 比如双链DNA 以双螺旋的形式存在, 蛋白质则经由\(\alpha \)-螺旋、\(\beta\)-折叠等结构完成组装. 为了研究生物大分子与水的相互作用, Cui等利用单分子力谱迫使高分子单链进入到不良溶剂中, 开展了生物大分子在水溶液与非极性溶剂中的对照研究(Cui et al. 2006, 2007). 双链DNA 在受到外力拉伸时, 可在约65 pN处观察到一个长平台, 对应于从B型双链DNA到其过度拉伸态的结构转变. 然而实验中发现, 在不同溶剂中力曲线存在着明显的变化.如果将水溶液替换为非极性溶剂(如二乙苯等), 不仅无法观测到指纹特征, 而且所得力曲线与单链DNA的一致.这一结果表明双链DNA在非极性溶剂中将变性为单链结构.在实验结果的基础上, 提出ssDNA与水分子之间的弱氢键可能是双链DNA稳定存在于水中的前提条件.原子力显微镜也被广泛应用与除DNA之外的许多小分子的力谱研究, 甚至包括了金颗粒(Xue et al. 2014)、纳米线(Marszalek et al. 2000)等非生物样品, 如图7(b)所示.早期的研究应用实例包括应用力谱分析技术在单分子水平上鉴定多糖混合物的组分(Marszalek et al.2001), 观察黄原胶分子与基底的结合力(Li et al. 1999a), 研究蚕丝素分子的纳米力学特性(Zhang et al. 2000), 观察肝素分子在外力作用下的力学性质(Marszalek et al. 2003), Fern\'{a}ndez课题组对泛素分子力学性质、及其与水分子相互作用的一系列研究等(Carrion-Vazquez et al.2003, Schlierf & Fern\'{a}ndez 2004, Brujić et al. 2006, Li et al. 2010).

图7   原子力显微镜力谱技术作用于小分子的各类实验设计. (a)低聚乙二醇共聚物长链分子在不用缓冲液成分下与金膜的结合力分析实验(Nash & Gaub 2012), (b)金颗粒纳米棒在探针作用下的力学及导电性分析实验(Marszalek et al. 2000), (c) 聚氧乙烯(PEO)链在其单晶中的折叠样式分析实验(Liu et al. 2011), (d)光敏分子受光照激发产生形变所带动的力谱分析实验(Hugel et al. 2002)

   

对生物大分子本身的弹性力学性质可以选择合适的理论模型, 对力曲线进行拟合得到拟合参数.生物大分子的机械特性参数主要是持久长度\((l_{\rm p}\), 虫链模型)、库恩长度\((l_{\rm k}\), 自由连接链模型)或旋转单位长度\((l_{\rm b}\), 自由旋转链模型).当力曲线偏离了上述FJC或WLC模型所能描述的形式时, 由单分子力谱得到的力曲线则往往体现着高分子链的构象或构型的变化.在这些力曲线当中, 我们往往能发现高分子的弹性呈现剧烈的变化, 例如在曲线中出现突然的弯曲.如果这一变化影响到了分子结构中相当长度的链段, 力曲线可能在一定的位移范围内出现一个力学平台.力导致的分子构象转变常常伴随着高分子主链的伸长, 典型的例子有聚多糖(Li et al. 1999b), 聚乙烯醇(Hugel & Seitz 2001), 例如聚多糖的椅式与船式的构象转变(Li et al. 2002)等.

此外, Sonnenberg等对聚丙烯酸单层进行了力谱实验, 观察其相对缓冲液pH值的函数, 以研究连接着基底与针尖两个表面的聚合物的黏附性质(Sonnenberg et al. 2007a). 该研究表明, 聚丙烯酸链和氮化硅探针针尖之间的相互作用力取决于聚合物单层的覆盖密度, 以及聚合物链的轮廓长度.聚合物桥连的稳定性由两个表面的黏合强度决定, 作为依赖性聚电解质单层, 这一强度可以通过使用缓冲液pH值来进行调节.Zhang课题组使用了单分子力谱技术结合受控分子动力学(steered molecular dynamics, SMD)模拟的组合, 研究聚氧乙烯(PEO)单晶中高分子链之间的相互作用, 以及聚氧乙烯(PEO)链在其单晶中的折叠样式, 如图7(c)所示(Song et al.2013, Liu et al. 2011). 研究结果表明, 将单个PEO链从其单晶中提拉出来的作用力大小约为40 pN, 在稀溶液中形成的晶体中的PEO链的折叠样式遵循就近排列的重入折叠模型.在从熔体获得的晶体中, 力曲线上出现的大幅度波动主要是由于折叠样式上大而无规律的环状结构引起的.Liang和Fern\'{a}ndez(2011)的工作研究了单分子亲核取代化学反应中机械能与热效应之间的关系.通过单分子力谱技术研究了TCEP, 1, 4-\(_{\rm DL}\)-DTT和氢硫化物阴离子, 对受机械拉伸作用的多肽二硫键的影响.在一系列精确控制的温度下记录双分子亲核取代(S\(_{\rm N}\)2)事件, 对力和温度引起的反应速率的影响的比较表明, 每增大50 pN的拉力等效于温度升高10 K. Nash和Gaub(2012)测量了单一共聚物分子与金表面的黏附特性, 如图7(a)所示.研究者发现共聚物在高离子浓度缓冲液中的脱水和坍缩, 导致保持分子桥连长度的分布显著降低.在高盐浓度下聚合物显示出较低的绝对解离力, 而协同作用增加了多链相互作用中每条链对应的解离力. 研究结果证实, 坍缩构象中的聚合物在金表面上占据的体积显著减少.这些结果证明在单分子水平下, 溶剂诱导的环境响应共聚物的坍缩能够以可控的方式调节表面黏附力和桥接长度的分布.

在力谱实验中, 绝大部分情况是由压电陶瓷扫描管作为驱动获得力曲线.但是有一些特殊的样品能够通过其他外界刺激发生形变, 则此时的力曲线信息是由样品驱动所得. 如图7(d)所示, 显示了光学转换为机械能的力谱实验(Hugel et al. 2002).实验中结合全内反射显微镜与力谱技术, 对双稳态光敏偶氮苯聚合物在光照下的收缩进行了测量, 成功发现聚合物链能够在特定光照激励下, 产生周期性的沿聚合物主链方向的收缩力.

整体而言, 对小分子进行操纵时, 非特异性的吸引或排斥作用可能对原子力显微镜的力测量产生很大的影响, 并会导致应力--位移曲线出现许多无法重复的特征而使短距离拉伸现象变得不明显.所以单分子力谱的研究对象主要集中于长链分子. 另一方面, 对长链分子的研究中拉伸实验能够做到让针尖和基底分别固定住长链分子的一端, 这样不仅使重复的单链拉伸成为可能, 而且能让针尖与基底之间的非特异性相互作用降到最低.

3.2 蛋白质

蛋白质是生物体内极为重要的功能性大分子, 是绝大多数生命过程的主要执行者. 同时蛋白质也是构成细胞的重要成分, 用以实现细胞内和细胞外的各种生物学功能.蛋白质通过多肽折叠成正确的三维空间结构来获得特有的生物学功能.当蛋白质发生错误折叠, 又未能通过细胞内的质量控制机制得以降解时, 错误折叠的蛋白质便会聚集形成淀粉样沉淀, 导致疾病的发生, 如神经退化性疾病、非神经系统性淀粉样变性、II型糖尿病等(Dobson 2003, Chiti & Dobson 2006).因此研究蛋白质的折叠过程对于认识蛋白质的生理功能及促进相关疾病的治疗都有着积极的意义.结构生物学手段可精确解析蛋白质的三维原子结构, 但蛋白质结构并非决定其生理功能的唯一因素, 化学成分、电荷分布、机械特性等因素同样影响蛋白质的生理功能(Kasas & Dietler 2008).基于原子力显微镜的力谱技术除了可对蛋白质的亲和力及分布进行测量外, 还能通过机械方式研究单个蛋白质分子的去折叠过程, 为蛋白质去折叠动力学及结构稳定性带来了新的认识(Müller et al. 2009). 细胞的质粒膜中包含有许多种膜蛋白, 诸如总膜蛋白由受体、离子通道、传输子以及一些与细胞外膜相关的特定抗原等.膜蛋白在细胞生理活动中起着关键性的作用, 如信号转导、能量转换、溶质输运和分泌、骨架锚定、酶活性、细胞黏附、细胞运动等, 而且是大部分药物的作用靶点.所以对膜蛋白进行研究不仅对理解生命活动的本质有着重要的价值, 还可为疾病治疗和医药研发带来帮助. 因而, 对蛋白质的力学性质进行研究是当今生物物理学的一个重要分支, 以膜蛋白为典型代表的蛋白质分子, 可以说是力谱技术在微观生物力学领域的开展最广泛、最深入的研究对象.

力谱技术在蛋白质领域的研究, 大体来说可以分为六个方向------研究单个蛋白质分子去折叠(unfolding)的过程; 研究缓冲液环境对蛋白质分子力学性能的影响; 通过设计蛋白质分子的组成结构研究其对蛋白质力学性质的影响; 采用力钳模式(force clamp)研究蛋白质在恒定作用力下的力学性质; 研究某一特定的参数变化对蛋白质力学性质的影响; 更深入地分析和模拟蛋白质分子动力学以及力曲线拟合模型.

3.2.1 研究单个蛋白质分子去折叠的过程

1997年, Rief等首次利用原子力显微镜的单分子力谱从单分子水平研究了肌联蛋白分子在外力作用下的拉伸行为.他们将蛋白质的两端分别连接于AFM 的探针与金基底之间, 然后通过操纵AFM 探针远离或接近基底, 实现对蛋白质分子的拉伸与松弛, 得到了如图8(a)所示的锯齿形力曲线.其中每个锯齿的力值约为150 \(\sim \) 300 pN (拉伸速率为1 \(\mu \)m/s), 相邻锯齿间的距离为25 \(\sim \) 28 nm, 每个锯齿形力曲线对应着Ig免疫球蛋白结构域逐步去折叠的过程. 此外, 在往复拉伸实验中发现, 当一个拉伸周期完成后, 如果撤销蛋白质上的外力使其完全松弛, 再对蛋白质链进行拉伸, 仍然能得到锯齿形力曲线.当蛋白质部分松弛时有些蛋白质结构域无法重新折叠回去, 表明结构域的去折叠与折叠过程在此实验中是可逆的, 同时也可以通过外部应力来控制折叠过程.

图8   原子力显微镜力谱技术研究单个蛋白质分子去折叠过程. (a)肌联蛋白Titin在外力所用下的机械展开(Fisher et al. 1999); (b)将单个细菌视紫红质分子从紫膜表面提拉迟来, 并对比拉伸前后的细菌紫膜表面成像区别(Oesterhelt et al. 2000)

   

2000年, Oesterhelt等(2000)首次应用单分子力谱技术研究了单个细菌视紫红质分子的去折叠过程, 细菌视紫红质分子是嗜盐细菌紫膜上的唯一蛋白质分子.实验中首先对吸附在云母表面紫膜上的细菌视紫红质分子进行成像, 对细菌视紫红质分子进行机械去折叠后再次进行成像, 如图8(b)所示, 证明对单个细菌视紫红质分子进行了机械去折叠.之后利用虫链模型对力曲线锯齿峰进行拟合后发现, 细菌视紫红质分子发生去折叠的部位依次为氨基酸88, 148和219位点.

上述两个实验为力谱技术应用于蛋白质分子研究开创了先河.在单个蛋白质分子去折叠实验中, 以膜蛋白为例, 一般是将含有重组膜蛋白的磷脂双分子层吸附到平整的基底(如云母), 首先进行扫描成像将针尖定位到膜蛋白上, 之后控制针尖以0.5 \(\sim\) 1 nN的力接触膜蛋白约0.5 \(\sim\) 10 s(施加过大的力容易破坏膜蛋白, 停留时间随蛋白质对针尖的吸附能力而异), 此时蛋白质多肽链会有一定的几率非特异性地吸附到针尖上, 在随后的针尖回退过程中依次去折叠膜蛋白的二级结构.由于结合几率比较低(约0.1% \(\sim \) 10%), 且不能控制蛋白质所吸附到针尖的具体位置, 因此需要在实验中选择能代表膜蛋白完整去折叠过程的力曲线进行分析.比如蛋白质分子的末端吸附到针尖时所得到的力曲线要比蛋白质中部吸附到针尖时的长.如果在C端或者N端设计一个特定长度的延长段(His-Tag), 那么相应端吸附时得到的力曲线轮廓长度就会增大相应的长度, 以此来区别针尖所吸附的特定位置. 上述过程的详细描述, 可以参见Bippes和Müller(2011)的综述文献.

此后单个蛋白质去折叠过程的研究蓬勃发展, 对肌联蛋白展开的后续研究发现了其去折叠过程的中间态, 并描绘了其动力学能谱(Marszalek et al. 1999, Schlierf & Rief 2006), Li 等(2002)在此基础上将Titin 蛋白质分子作为一个弹簧处理, 从总体上了解其机械特性.笔者的实验进一步证明了去折叠过程中间态由于其与外力加载速率高度独立的性质, 起到了"力学缓冲"的作用, 其建立的动力学能量壁垒大大延长了I27蛋白质的寿命.实验数据建立了肌联蛋白动力学和拓扑结构间的联系.诸如I27的肌联蛋白末端结构域能够缓冲外力, 分子动力学模拟显示连接\(\beta \)折叠A的氢键断裂时形成了去折叠中间态.末端Ig蛋白质中, 连接\(\beta \)折叠A, B, G的氢键相互作用力, 能够在生理环境所能施加的外力加载速率下, 维持Ig蛋白质折叠结构能垒的稳定. 因此, 能够使蛋白质进入去折叠过程的作用力保持恒定.这一末端Ig中的机制能够使结构域在生理环境产生的外力下保持稳定, 从而在宏观上使肌联蛋白具有了外力吸收能力, 显著降低了意外进入去折叠过程的几率(Nunes et al. 2010).随着设备的进步, 目前已经可以在接近分子动态模拟的时间尺度上进行快速的去折叠实验(Rico et al. 2013).

Oberhauser等(1998)通过单分子力谱研究单个细胞外基质肌键蛋白去折叠的分子机理, 拉伸肌键蛋白得到锯齿状去折叠的力曲线, 并测得力值为137 pN, 肌键蛋白被拉长后长度可达到静止状态的数倍, 显示出肌键蛋白具有良好的弹性.Müller等(1999a)用单分子力谱研究耐辐射异常球菌外膜上由6个单个原体组成的六角形HPI蛋白质复合体, 所得的力曲线具有6个等距峰, 显示单体间的相互作用力约为300 pN, 相应的形貌图显示, 当针尖回缩时, 整个HPI离开表层并留出了一个空位.Alsteens等 (2009)通过单分子力谱研究了酵母活细胞表面以及修饰在金表面的细胞黏附蛋白质Alps5p的黏性及机械性质, 测得在这两种条件下细胞黏附蛋白质Alps5p去折叠力值相近, 力值范围均在150 \(\sim \) 250 pN之间, 并发现在拉伸细胞黏附蛋白质Alps5p的过程中主要是它的串联重复序列发生了去折叠.Sapra等(2009)研究了跨膜蛋白OmpG的去折叠过程, 将大肠杆菌磷脂分子层(含有重组OmpG 蛋白质分子)吸附到云母表面, 并对单个OmpG分子进行机械去折叠, 揭示出OmpG分子发生去折叠的部位依次对应其中的\(\beta \)折叠位点.Thoma等 (2012)研究了跨膜蛋白FhuA的去折叠过程, 将FhuA表达于大肠杆菌并将收集提纯的FhuA重组于大肠杆菌磷脂双分子层上, 首先对FhuA分子进行了高分辨率成像, 随后通过力谱技术机械拉伸单个FhuA分子得到反映FhuA去折叠过程的力曲线, 虫链模型拟合结果表明了FhuA发生去折叠部位的各个氨基酸位点.

对于较大的蛋白质, 其经常表现出多个承受力单元, 使得蛋白质的去折叠不是"全或无"的过程, 而是显示出一系列的中间态, 比如绿色荧光蛋白(GFP) (Bertz et al. 2008, Mickler et al. 2007)、强化黄色荧光蛋白(EYFP) (Perez-Jimenez et al. 2006)、T4溶菌酶(T4 lysozyme) (Peng & Li 2008)、艾滋病毒1型受体蛋白CD4(Perez-Jimenez et al. 2014)、人体晶状蛋白(Garcia-Manyes et al. 2015)、麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein) (Aggarwal et al. 2011)以及巨肌蛋白激酶(titin kinase)等(Puchner & Gaub 2009, Pernigo et al. 2010).

这些研究均直观地揭示出蛋白质分子的去折叠过程, 对比与传统生化方法研究蛋白质去折叠过程时需要对大量分子进行检测, 原子力显微镜力谱技术可以直接对天然状态下单个蛋白质分子进行机械去折叠, 能帮助我们从单分子尺度来认识蛋白质分子去折叠过程中的力学行为, 而不再是大量分子的平均结果.将力谱技术获取的单分子尺度信息与传统方法获取的集群平均信息进行结合, 将能使我们更好地认识蛋白质的生理功能, 对揭示生命现象的本质、提高疑难疾病诊治能力具有重要意义.

3.2.2 研究缓冲液环境对蛋白质分子力学性能的影响

笔者所在的Müller课题组长期致力于蛋白质的去折叠过程研究, 通过对不同条件下蛋白质分子的去折叠路径进行了研究, 发现其去折叠路径并非固定不变, 而是会随着外部环境条件(如温度、电解质、低聚组装、结构修改等)的改变而变化.通过研究脂溶性膜蛋白的去折叠过程, 能够推测出该过程的能垒图谱.根据不同的外部环境, 观察该条件下蛋白质能垒图谱的变化, 可以判断该条件下蛋白质的力学性质变化, 例如结合了活化作用或者抑制作用的配体等, 为药物的设计与筛选提供参考.

图9所示是笔者对电压依赖性阴离子通道膜蛋白VDAC的研究.该实验表明, 缓冲液中钙离子浓度的增大将会显著降低VDAC蛋白质的结构稳定性和构象多样性(Ge et al.2016). 在对多肽转运蛋白DtpA的力谱研究中, 发现了其存在两种构象, 而在蛋白质与抑制剂结合后, 其中一种构象被检测到的几率有了大幅度的提升(Bippes et al. 2013).在对类肾上腺素蛋白质的研究中, 发现了缓冲液中的胰岛素蛋白质分子对其去折叠过程能谱的影响(Zocher et al. 2012a). 在对蛋白质乳糖转位酶(LacY)的研究中, 采用力谱技术观察了半乳糖苷结合对LacY动力学的影响, 结果表明对糖结合至关重要的N末端和第五\(\alpha \)螺旋区间来说, 动力学、能量和机械性质发生了明显变化, 而C末端在很大程度上不受影响(Serdiuk et al. 2014).

图9   原子力显微镜力谱技术研究缓冲液环境对蛋白质分子力学性能的影响------阴离子通道VDAC膜蛋白分子在不同缓冲液环境中去折叠能谱的变化研究(Ge et al.2016)

   

金属离子在蛋白质去折叠过程中的影响, 也是一个被广泛研究的对象.在铁硫蛋白rubredoxin中的铁硫中心FeS\(_{4}\)模型系统的一系列力谱研究中, 证明了分子水平的机械各向异性, 研究了单分子水平上最简单的铁硫蛋白(rubredoxin)活性位点铁的机械解离机理.研究结果表明, 金属结合部中心的机械断裂是随机的, 并且遵循多个复杂的途径, 展示了铁氧还蛋白中FeS\(_{4}\)中心的两种化学反应: 亲电质子化和亲核配体取代. 研究结果表明, 质子化和配体取代导致FeS\(_{4}\)中心的机械不稳定, 这对了解金属离子离解的机制基础具有广泛的意义(Zheng et al. 2013a, 2013b, 2015). 在对小蛋白质GB1的力谱研究中发现, 双组氨酸金属螯合可以显著及可逆地增强蛋白质的机械稳定性.研究结果表明, 金属螯合可以提高GB1的机械稳定性高达100 pN (Cao et al. 2008). 在对Na\(^{ + }\)/H\(^{ + }\)逆向转运蛋白(NhaA)的动态组装和复性过程研究, 以及细菌Rho在外加载力下的复性研究中, 发现了钠离子对复性的关键性影响(Kedrov et al. 2008, Kedrov et al. 2006, Kessler et al. 2006).在对天然牛视紫红素的研究中, 发现了锌离子对蛋白质稳定性的影响(Park et al.2007). 在对金属结合蛋白G6-53的力谱研究中, 在单分子水平存在辅因子(镍离子)的情况下探测了蛋白质的折叠动力学过程(Cao & Li 2011a).

总之, 蛋白质选择特异的去折叠途径与其局部电荷、环境以及氨基酸复杂的相互作用有关, 如分子伴侣(Mashaghi et al. 2013, Nunes et al. 2015)或其他辅因子的外部试剂(Puchner & Gaub 2012, Perez-Jimenez et al.2011), 也会对蛋白质的稳定性和折叠途径产生影响.

3.2.3 通过设计蛋白质分子的组成结构研究其对蛋白质力学性质的影响

对于一些对温度和自身的化学环境(酸碱度、盐离子浓度、溶剂等)敏感的蛋白质, 如酶类, 可以利用热变性或化学变性的方法来研究其空间结构的稳定性及去折叠过程.但对于如肌蛋白等弹性蛋白质, 其对机械力的敏感程度远大于对温度和所处化学环境的敏感程度.对于这类蛋白质, 在施加外力的情况下使其变性, 研究其折叠与去折叠过程, 进而揭示其结构与性质的关系更有实际意义.

弹性蛋白质在生物力学系统中是一个重要的功能基本单元, 因为它们具有理想的弹性力学强度和抗性. 弹性蛋白质是天然黏合剂, 可以作为细胞黏附和肌肉蛋白质弹性的基础, 也可以作为具有极好机械性能的结构材料.随着对蛋白质力学性质了解的不断深入, 采用蛋白质人工构建新型材料的研究有了重要的进展(Guerette et al. 1996, Smith et al. 1999, Ardell & Andersen 2001, Becker et al. 2003, Elvin et al. 2005, Lyons et al. 2007).例如人们已经能够利用已知的蛛丝蛋白质的结构合成具有非常好的延展性和强度的人工材料(Wong et al.2012), 这种方法也为制造下一代力学稳定的生物材料指明了方向(Heim et al. 2009).

单分子力谱可以直接探测弹性蛋白质在单分子水平上的机械性能, 并揭示弹性蛋白质分子设计原理. 结合单分子力谱和蛋白质工程技术, 已经可以使用定制的纳米力学性质来设计蛋白质(Li et al. 2007).研究发现, 人工合成的弹性蛋白质, 如GB1蛋白质链, 其力学性质类似甚至超过了天然的蛋白质(Cao & Li 2007).为了利用蛋白质构建人工新型材料, 将其应用到纳米力学系统中作为弹簧、转换器或者感应器, 需要设计一系列具有特定纳米力学性质的人造弹性蛋白质, 例如力学稳定性、延展性和柔韧性等(Lü et al. 2010). 总之, 在纳米尺度下理解它们的结构特性和力学性质, 才能让我们更有效和全面地利用它们.蛋白质力学特性的单分子力谱为此提供了有效途径.

图10所示的实验通过设计蛋白质分子的组成结构, 研究了其对蛋白质力学性质的影响(Cao et al. 2007)单一的NuG2蛋白质串每个结构域去折叠作用力峰值约为100nN, 结合了hFc的NuG2蛋白质串每个结构域去折叠作用力的峰值约为200nN.通过蛋白质工程技术, 以8个NuG2蛋白质串为基底, 在其上选择性地结合上4个hFc蛋白质. 在新的力谱实验中可以发现, 不论哪个NuG2蛋白质单元结合了hFc蛋白质, 力谱曲线中总是会首先出现4个100nN的锯齿峰, 这说明在蛋白质串中总是没有结合hFc蛋白质的单一NuG2蛋白质单元最先去折叠.类似的现象也在T4溶菌酶和GB1蛋白质串的设计中得到验证, 夹在GB1蛋白质串中的T4溶菌酶由于具有更低的结构稳定性, 力谱实验中其对应的锯齿峰也会先于稳定性更高的GB1蛋白质锯齿峰出现(Peng & Li 2008). 此外, 类似的实验设计还包括用GB1蛋白质串串联其他的目标分子, 如GL5/I27w34f; 用GL5蛋白质串串联T4L目标蛋白质; 用Ig27蛋白质串联GV54P目标蛋白质等(Peng & Li 2009a, 2009b; Cao et al. 2008).

图10   通过设计蛋白质分子的组成结构研究其对蛋白质力学性质的影响(Cao et al. 2007a)

   

3.2.4 采用力钳模式(force clamp)研究蛋白质在恒定作用力下的力学性质

力钳模式(force clamp)是原子力显微镜力谱技术中的一种功能模式.与普通力曲线模式不同的是, 在此模式下系统试图维持恒定的作用力.所以相对于常规力谱模式中以恒定速度移动扫描管记录作用力, 力钳模式为了维持恒定的悬臂梁弯曲量而记录扫描管的移动.力钳模式的实现机理, 在Popa等的著作中有标准化的操作流程(Popa et al. 2013b), 如图11所示.力钳模式得到的力曲线最主要的特点是其横纵坐标分别为时间和位移, 而不是典型的位移--力曲线.

图11   采用力钳模式(force clamp)研究蛋白质在恒定作用力下的力学性质(Popa et al.2013b)

   

单分子力钳技术已成为研究蛋白质折叠/去折叠、化学键断裂和酶反应的有力工具.研究者们已经开发了不同的方法来分析多聚蛋白质的力钳谱数据, 以获得表征蛋白质的机械去折叠的动力学参数, 其通常被建模为双态过程(泊松过程). 实验证明这些方法是等效的, 并都能实现去折叠过程速率常数的精确测量, 同时力钳方法并不受多聚蛋白质中蛋白质结构域数目的限制, 可以通过模拟数据集指出使用单分子力钳技术来表征蛋白质的去折叠能谱时需要考虑的重要实际因素(Cao & Li 2011b).

力谱技术被用于研究特定力作用下样品的响应, 比如以较高的外力将蛋白质拉伸并去折叠后, 可以线性的放松作用力来观测其坍缩机制(Walther et al. 2007).观察结果表明各种蛋白质的坍缩过程中存在显著差异, 实验证实这些差异主要是由于各蛋白质的疏水相互作用差异产生的.该机制对于高度延展的蛋白质是常见的, 包括弹性蛋白质如PEVK.观察结果解释了高度延展的蛋白质的折叠行为与化学或热变性后折叠的差异.在HaloTag蛋白质机械性能研究的力钳实验中, 显示出HaloTag蛋白质对外力拉伸的灵敏度是L蛋白质的两倍, 并且再折叠的速率更低.实验展示了如何能够在高强度下长期观察蛋白质的折叠--去折叠循环, 而不会受到HaloTag栓系(tether)的干扰(Popa et al. 2013a).

机械力对控制化学反应性能的影响在很大程度上是未知的, 据此力钳技术对蛋白质二硫键断裂过程展开了一系列的研究.在单分子力钳法探测硫氧化还原蛋白(Trx)催化的化学过程实验中, 通过对基质二硫化物施加特定作用力, 可以在单分子水平上探索8种不同成分的硫氧还蛋白酶催化的化学机制.实验数据表明当二硫键在低外力下拉伸时, 虽然所有的Trx都显示出了特征性Michaelis-Menten机制, 但是其表现出了两大类化学行为, 能够区分出其源自细菌还是真核生物, 真核生物的硫氧化还原蛋白通过单电子转移反应来减少二硫键(Perez-Jimenezand et al.2009). 通过将机械力在25 \(\sim\) 600 pN的范围内应用于二硫键底物, 并监测各种酶的二硫键的还原, 检测到催化反应的两种替代形式. 第一种需要底物二硫键取向重排, 导致底物多肽的长度缩短0.79 \(\pm \) 0.09 {\AA}; 第二种将底物二硫键延长0.176 \(\pm \) 0.02 {\AA}.这些结果与类似的一系列实验结果相符, 暗示Trx活性位点以亚纳米级的精度调整参与反应的硫原子的几何形状, 以实现有效的催化(Wiita et al. 2006, Koti Ainavarapu et al. 2008).在氧化应激和机械损伤条件下, 如心血管疾病患者中, 底物构象变化对Trx活性的调节可能很重要(Wiita et al. 2007).

Alegre-Cebollada等(2011)测量了蛋白质中二硫键异构化的动力学过程.通过捕获硫醇和邻位二硫键之间的区域特异性反应, 实现了单一蛋白质中活性物质的机械释放. 实验者首先设计了一种蛋白质, 其中包含笼状半胱氨酸和二硫化二苯. 在存在外部亲核试剂的情况下, 该蛋白质的机械去折叠释放出单个反应性半胱氨酸残基, 通过其两个硫原子之一上的亲核攻击可以切割目标二硫键.这产生两个不同的竞争性反应途径, 通过单分子力谱来监测二硫化物的切割, 使得多肽与每个反应途径明确地相关联.蛋白质工程与单分子力钳技术的结合使我们能够研究机械力对双分子取代反应(S\(_{\rm N}\)2)中亲核试剂蛋白质二硫键还原速率的影响.羟基阴离子切割蛋白质二硫键的断链过程, 在500 pN处显示为一个突然的"开关"状态, 此后外力对S\(_{\rm N}\)2化学反应速率的加速作用大大减弱.由此推论外力诱导下蛋白质二硫键的突然构象变化使其基态发生变化, 大大改变了其在S\(_{\rm N}\)2化学反应中的反应性.实验直接证明了力激活开关在单个分子的化学反应性中的作用(Garcia-Manyes et al.2009).

3.2.5 研究某一特定的参数变化对蛋白质力学性质的影响

在单分子力谱研究蛋白质力学性质的实验中, 还有一些重要的参数和特定的因素会对实验结果产生影响, 例如对蛋白质特定位点的突变、蛋白质结构中的拓扑关系、拉伸蛋白质的外力方向, 以及蛋白质所处的脂膜环境等.

视紫红质中的几个氨基酸位点的突变会引起视网膜疾病, 例如G90D点突变会导致先天性静止性夜盲, 导致功能障碍的机制在分子水平上了解甚少. 单分子力谱表明, 突变引入的结构变化很小. 但是动态单分子力谱分析显示, 与暗态野生型视紫红质相比, G90D突变降低了暗态突变体受体大多数结构区的能量稳定性和机械刚度, 提出可能存在由病理点突变而引起的能量和机械性质变化的见解. 此外, 对于暗态G90D视紫红质, 观察到的这些改变后的性质, 与活性状态的性质一致(Kawamura et al. 2012).

免疫球蛋白状模块是在细胞中发挥机械作用的蛋白质的常见组分, 例如肌肉弹性和细胞黏附. 这些蛋白质的突变可能影响其机械稳定性, 从而可能损害其功能. 使用单分子力谱技术和蛋白质工程, 研究人员证明了人心脏免疫球蛋白模块的两个\(\beta\)链中的点突变改变了蛋白质的机械稳定性, 其所导致的机械表型可能在细胞黏附和肌肉蛋白质中是常见的(Li et al. 2000).

GB1是一种具有显著机械稳定性的小蛋白质, 其剪切拓扑在确定其机械稳定性方面起着重要的作用.结合单分子力谱和蛋白质工程技术, 研究了侧链还原和疏水核心外壳对GB1机械稳定性的影响.通过设计七点突变体, 对GB1的机械展开进行了分析.研究者发现在疏水核心(F30L/Y45L/F52L)中, 通过施加的拉伸力, 两个剪切的功能域表面上的三个突变导致GB1的机械展开力的显着降低.与野生型GB1相比, 这些突变体的机械展开力下降了50 \(\sim \) 90 pN, 以400 nm/s的拉伸速度时在约180 pN下去折叠. 结果表明, 疏水核心外壳在确定GB1的机械稳定性方面起重要作用, 并表明优化与剪切结构表面的疏水相互作用, 可能是提高GB1和GB1同系物机械稳定性的有效方法(Bu et al. 2012).此外, 在蛋白质受力区域之外的突变也可以降低蛋白质的力学稳定性(Balamurali et al.2008, Ng et al. 2007).

蛋白质的三维结构是其实现功能的重要因素, 单分子力谱技术既可以对其整体结构进行研究, 还能特异性地研究其中的结构片段和线圈构象.打结的多肽链是蛋白质中奇特的拓扑特征之一.了解打结蛋白质克服去折叠过程已成为一个具有挑战性的问题.通过拉伸打结的蛋白质, 可以解开或收紧打结的多肽.He等(2014)通过单分子力谱和受控分子动力学模拟来研究如何通过施加的拉力将结合蛋白AFV3-109转化为紧密的三叶结.研究结果表明, 通过拉动AFV3-109的N末端, 蛋白质可以通过多个途径去折叠.蛋白质打结的部分转化为涉及约13个氨基酸的紧密三叶结, 多肽链会明显缩短约4.7 nm. SMD模拟结果与实验结果基本一致, 为AFV3-109的机械展开和结紧固提供了一个合理而详细的分子机制.这些模拟显示, 在去折叠期间, 打结环与剪切\(\beta\)链之间的相互作用提供了高机械阻力. Bornschlögl等(2009a)通过使用蛋白质工程和单分子力谱研究了红外感光光敏色素发色团结合域中的"8"字结的力学特性.在外力作用下, 光敏色素在约47 pN的作用力下展开, 而携带其共价结合的四吡咯发色团的光敏色素在约73 pN处展开.这些数值的大小在蛋白质去折叠过程中并不罕见, 因此打结的存在并不代表会产生超级稳定的蛋白质结构. 在展开的链中, 收紧的结涉及到17个氨基酸, 导致多肽链明显缩短了6.2 nm.受控分子动力学模拟证实了这个数值.

项圈结构是另一种特殊的拓扑结构.在单分子力谱研究黑腹果蝇的1型驱动蛋白颈圈结构解缠动力学实验中, 发现即使蛋白质整体热力学稳定性低时, 项圈结构在拉伸速度大于150 nm/s时, 其平均解缠力仍然大于11 pN.这种高解缠力确保了分子马达运动过程中的结构完整性.与传统的亮氨酸拉链相比, 项圈结构通过非常窄的N末端展开屏障实现了高机械稳定性(Bornschlögl et al.2009b). 通过对Rho分子力谱的研究, 表明Rho可分为数个结构片断, 这些结构片断相互作用稳定了分子结构. 在缺乏Cys1102-Cys187键的情况下, 分子内结构片断的位置及稳定性发生了改变, 从而影响了一些高度保守残基的稳定性, 说明了Cys1102-Cys187键对分子结构稳定的重要性(Sapra et al. 2006).

蛋白质的稳定性不只取决于蛋白质的拓扑结构, 同时也被拉伸方向影响.因此蛋白质力学强度一个重要的特性就是在不同的拉伸方向上具有不同的强度, 也就是各向异性. 这主要是因为和蛋白质的热力学稳定性不同, 蛋白质的力学去折叠是在一个特定的、被施加外力的方向所决定的反应轴上进行的.因此施加在同一个蛋白质的不同方向上的外力得到的蛋白质力学性质是不同的(Bertz et al.2009).单分子力谱实验和分子动力学模拟结果都给出了直接的证据. 例如, 对于丙酮酸盐脱氢酶的一个小结构域E2lip3, 从不同方向拉伸的实验和分子动力学模拟显示出这一性质(Brockwell et al. 2003). 同样, 对多聚泛素(ubiquitin polyprotein), 去折叠作用力需200 pN, 此时的拉伸方向为N 端和C端. 但若在Lys48和C端的方向拉伸, 蛋白质的稳定性则降低了两倍.不同的去折叠路径在单分子动力学模拟中也得到证明(Carrion-Vazquez et al. 2003). 在Dietz等(2006)的工作中, GFP 在不同的位点被交联起来, 表现出了多种去折叠过程, 在拉伸方向的弹性系数从10 N/m到170 N/m不等.

近年来利用磷脂纳米盘模拟膜蛋白的天然环境吸引了科研人员的注意.纳米盘利用膜支架蛋白质来包裹磷脂双分子层, 直径为9 \(\sim\) 17 nm, 其主要优点是突破了传统脂质体/脂质体融合实验方法的限制, 可溶于水、且比脂质体更稳定, 实验结果更可靠(Shi et al. 2013).Zocher 等(2012b) 将膜蛋白插入到纳米盘中, 利用单分子力谱技术分别对纳米盘中的细菌视紫红质分子和天然环境下(紫膜)的细菌视紫红质分子进行机械去折叠, 发现两种情况下细菌视紫红质分子的去折叠过程一致, 表明可以通过将膜蛋白重组到磷脂纳米盘中来研究其去折叠过程, 这使得高通量单分子力谱实验成为可能.

3.2.6 更深入地分析和模拟蛋白质分子动力学以及力曲线拟合模型

膜蛋白去折叠过程会导致力曲线上产生很多锯齿状的突变峰, 每个突变峰均对应膜蛋白一个片段的去折叠过程.基于Bell-Evans模型推导出了蛋白质去折叠所需力与拉伸速率之间的关系, 揭示了蛋白质力学强度的动力学特性. 当拉伸速率较低时, 去折叠力将正比于拉伸速率, 对于较大的拉伸速率, 去折叠力与拉伸速率成指数关系(Bell 1978, Evans & Ritchie 1997). 通常利用虫链模型(worm-like chain)对力曲线上的各个突变峰进行拟合, 在虫链模型WLC拟合所得到的4个参数中, 每个结构域的能量势垒\(\DeltaG_{0}^\ddag \)的大小反映了跨越该能量势垒的难度, 此值越大越需要更大的作用力去克服, 可以反映结构域的稳定性; 活化态到结合态的距离\(x_{\rm u}\)反映了结构域能够容纳的构象变化, 此值越大则代表在去折叠过程中结构域可能出现的构象形态越多; 不施加外力平衡态条件下的复合物解离速率常数\(k_{\rm off}(0)\), 此值越大说明在自然条件下发生解离的速率越大, 结构域不稳定性越高; 等效弹性系数\(\kappa \)反映了结构域的机械力学参数, 此值越大表示结构域的机械硬度越强.通过上述参数可以描绘出去折叠动态过程的能量图谱(Janovjak et al. 2004, Kuo et al. 2010, Schoeler et al. 2015).也有研究表明这一能量图谱的表面粗糙而非平滑(Janovjak et al. 2007).近年来随着模型的优化已经有高度集成化的分析软件(Lamour et al. 2014), 同时随着设备性能的提升, 已经逐渐展开了这一模型在高速拉伸下的分析(Junker & Rief 2010, Berkovich et al. 2012).

3.3 细胞

细胞是生命活动的基本单位, 其力学特性与生命体的功能有着紧密的联系.对细胞力学特性进行研究可以揭示生命体生理病理状态, 为临床诊断提供可靠依据, 推动病理机制的研究.细胞力学特性包括许多方面, 如细胞的弹性、黏度和硬度等, 与生理、病理和药理的过程有着必然联系, 并与细胞黏连、可变形性、细胞的运动、侵袭和转移有着密切联系.包括对细菌的研究也可以归结在本小节中讨论, 对于细菌关注较多的是细菌表面起黏附性作用的分子, 而对于细胞主要探讨细胞膜整体或被探测位置的机械性质.原子力显微镜以其独特的工作方式已成为细胞力学特性研究的强有力工具.与传统技术相比, 它具有诸多优点: 样本制作简单且不受导电性影响, 易于操纵; 能在溶液环境下进行活体细胞的实时观测和皮牛级微弱力的测定; 纳米级的高空间分辨率等特点.

细胞力学性质参数的定量研究取决于针尖和样品的接触面积, 但是由于细胞作为柔软界面, 接触面积会随着压入深度非线性增大, 故而难以确定. 为了避免这个问题, 可以采取以下三种方法解决: (a)限制压入深度, 仅使针尖的最末端与样品相互作用; (b)将纳米或微米级的球形颗粒黏附到悬臂的末端作为探针, 以更准确地估计接触面积并确立拟合模型; (c)将活细胞限制在楔形的原子力显微镜悬臂和支撑细胞的基底这两个平行板之间.在这一狭小空间中, 细胞皮层张力和压力之间的相互作用可以通过拉普拉斯定律描述(Fischer-Friedrich et al.2014), 从而允许流变力学的测量. 上述三种方法的示意图如图12所示.

图12   原子力显微镜力谱技术用于细胞力学性质的实验构架.(a)采用锥形针尖按压细胞表面, (b)采用球形针尖按压细胞表面, (c)采用楔形针尖按压细胞表面(Alsteens et al. 2017a)

   

在细胞力学性质的研究中, 探索细胞杨氏模量随环境参数的变化是非常重要的一类实验.杨氏模量是弹性材料在一定的弹性范围内, 正向应力与正向应变的比值, 它反映材料的刚度. 杨氏模量初期主要应用于物理学领域, 目前在医学和生物学领域也得到了广泛应用.细胞的杨氏模量的各种拟合模型, 主要包括赫兹模型(Johnson et al. 1987)、Sneddon模型(Sneddon et al. 1965)、DMT(Derjaguin-Müller-Toporov)模型(Derjaguin et al. 1975)以及JKR模型(Johnson et al. 1971).

赫兹模型成立的两个前提条件是压入物呈抛物线形和样品厚度足够大(相对于针尖压细胞的深度), 同时要求样品表面连续且光滑, 实验过程中样品形变量相对较小(Kuznetsova et al. 2007, Costa 2003).当探针为球形时, 赫兹模型为 \[ f_{\rm sphere} =\dfrac{4}{3}\dfrac{E}{1 - v^2}\sqrt R \delta ^{3 / 2} \ \ (7)\]

赫兹模型是目前最为通用的一种模型, 其假定针尖--样品的作用为线性弹性关系, 忽略黏附力或其他表面间相互作用的影响.原始赫兹模型仅适用于半球状针尖, 后来Sneddon对其进行了扩展, 将其他轴对称几何形状包含在内, 当探针为锥形时, 赫兹模型变为Sneddon的形式\[ f_{\rm cone} = \dfrac{2}{\pi }\dfrac{E}{1 - v^2}\delta^2\cdot \tan \partial \ \ (8)\] 式中, \(f_{\rm cone}\)和\(f_{\rm sphere}\)分别是探针为锥形和球形时对细胞施加的作用力; \(E\)为杨氏模量; \(\nu \)为泊松比, 对于生物样本泊松比通常取值为0.5; \(\partial\)为探针半开角; \(R\)为探针半径; \(\delta \)为压痕深度(Granzier & Pollack 2000).

根据赫兹模型的假定可知: 细胞受到压力时, 会产生较大形变, 此时赫兹模型就不再准确. 这时就需要引入其他模型, 例如DMT和JKR模型.DMT模型为考虑了接触区域外样品黏附力的模型, DMT模型适用于黏附力较弱但仍可测到的样品.引力作用如黏附力只存在于在接触面积之外.DMT模型对刚性较大而黏附力较低的样品, 以及和与样品压痕深度相比针尖半径相对较小的样品最为有效.Johnson-Kendall-Roberts(JKR)模型考虑了接触区域内的样品黏附力, JKR模型适用于针尖和样品之间除了有弹性相互作用之外, 还有较强的的黏合接触. 黏附力的影响只存在于接触面积内部.适用于针尖半径远大于压痕深度, 如相对柔性的材料.两者的模型表达式如下, 其中\(\gamma \)为黏附力做功\[F_{\rm (DMT)} = - 2\pi \cdot \gamma R\ \ (9)\]\[F_{\rm (JKR)} = - \dfrac{3}{2}\pi \cdot \gamma R\ \ (10)\]Ladjal等(2009) 研究了小鼠胚胎干细胞的力学特性, 结果表明基底效应(针尖对细胞施加压力到一定程度时会和修饰细胞的基底发生相互作用)对细胞杨氏模量的测定影响较大, 一般来说, 测量值要比真实值大2 \(\sim \) 3个数量级.因此为了更好地拟合实验数据, 对样品的压入深度, 最好限制在样品厚度的10%以内(Calzado-Martín et al. 2016).

使用锥形针、球形针和楔形针研究细胞力学性质, 都有大量的应用实例(Müller & Dufrêne 2011, Alsteens et al.2017a).

锥形探针的使用能够很好地控制压入深度, Gavara和Chadwick(2012)在测量成纤维细胞特定位点的杨氏模量时, 发现使用锥形效应校正的模型能大幅提高测量的精确度, 进而克服基底效应对杨氏模量测定的影响.Mathur等(2001)通过力谱实验计算出骨骼肌细胞、心肌细胞和内皮细胞的弹性模量, 分别约为100.3, 24.7和1.4 \(\sim \) 6.8 kPa.B\'{a}lint等(2007)用力谱研究了甘露醇对脑血管内皮细胞形状和力学性质的影响.通过力曲线测量细胞的弹性, 发现未经甘露醇处理细胞的杨氏弹性模量为(8.04 \(\pm \) 0.12) kPa, 而经甘露醇处理后细胞变软, 其杨氏弹性模量为(0.93 \(\pm\) 0.04) kPa.Chouinard等(2008)通过力谱实验发现氧化修饰的低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)硬度有影响, 而低密度脂蛋白对HUVEC的硬度无明显影响, 这个研究在一定程度上反映细胞性质.Lam等(2007)研究了化疗对白血病细胞硬度的影响, 当暴露于地塞米松或柔红霉素时, 白血病细胞硬度增加了近2个数量级, 从而减少了其通过微流体通道的途径. 这一结果, 与Cross等(2007)的研究相符, 他们发现癌症病人的细胞具有显著更低的杨氏模量. Azeloglu 和Costa (2009)对自然搏动下新出生大鼠的心肌细胞杨氏模量进行了测量, 结果表明, 其杨氏模量在舒张期的(7.8 \(\pm \) 4.1) kPa和收缩期的(26.2 \(\pm \) 5.1) kPa之间循环.在外界环境改变的情况下, 细胞的杨氏模量和黏附力等力学特性也会产生相应的变化.Jin等(2011)对HEK293 细胞用脂质体处理24 h 后, 发现细胞形貌有显著改变, 存活性降低, 同时针尖-细胞间作用力明显减小, 这可能是因为存在于HEK293 细胞表面的黏弹性分子表达程度有所下降.Lin等(2013)同样对HEK293 细胞进行了研究, 结果表明强力霉素或者亚麻酸LA都可以导致DoxGPR120的表达, 进而影响细胞膜的物理化学性质、生物化学性质及其杨氏模量.Volle等(2008)对大肠杆菌Escherichia coli ZK1056在噬菌蛭弧菌Bdellovibrio109J感染前后的弹性变化进行了研究, 结果显示: 未感染Escherichia coliZK1056的细胞的平均弹性常数为(0.23 \(\pm \) 0.02) N/m, 在受到感染后变为(0.064 \(\pm \) 0.001) N/m, 表明受感染后的细胞比未感染的细胞更软.

球形探针是对悬臂梁进行了改造, 用已知直径和材料的球形颗粒取代锥形探针, 这样便能够以更加准确的模型对力曲线进行拟合. Carl和Schillers(2008)对生理条件下的中国仓鼠卵巢细胞力学性质进行了分析, 分别使用锥形的尖锐针尖和不同尺寸和材料的球形颗粒探针研究了压痕探头的几何形状对结果的影响.结果显示球形探针的球体半径在0.5 \(\sim \) 26 \(\mu \)m这一相当宽的范围内变化, 并不影响测量的结果; 而锥形尖针测得的细胞杨氏模量(约1300Pa)比使用球形探针所得数据(约400Pa)要高.Shinto等(2012)利用力谱技术对小鼠肿瘤细胞和聚苯乙烯小球之间黏附力进行了分析, 研究了微球直径和接触时间对黏附力的影响.Iyer等(2009)通过球形探针考察细胞表面上的毛刷层, 来定量研究正常人和癌症患者宫颈上皮细胞之间的差异.毛刷层主要由微绒毛、微环和纤毛组成, 它对于细胞与环境相互作用是非常重要的.发现正常细胞具有一个统一长度的毛刷层, 而癌细胞显示具有显著不同密度的长、短两种的毛刷层.观察到的差异表明, 通过机械手段表征细胞表面时应考虑毛刷层.Krieg等(2008a)使用力谱技术结合球形探针, 量化地研究了来自斑马鱼胚胎的个体外胚层、中胚层和内胚层细胞的黏附力和机械性能.数据显示由Nodal /TGF\(\beta \)信号转导(转化生长因子\(\beta)\)调节的差异性肌动球蛋白依赖性细胞--皮层张力, 构成了指导祖细胞分选的关键因素.Gonnermann等(2015)基于力谱技术与光学显微镜结合, 检测了力谱弹性和黏附测量期间导致的运动性膜泡行为, 对非洲爪蟾颅神经峰(CNC)细胞的形状变化, 通过使用侧视配置, 定量研究了与膜泡形成的相关机械变化, 并比较了在膜泡和非膜泡期间记录的细胞弹性值, 膜泡突起显示出显著更低的刚度. 此外, 数据显示在细胞--细胞接触区域内形成的膜泡对细胞黏附力具有不利影响, 这表明与膜泡突起相关的机械变化促进了细胞分裂, 防止黏附增强.

用无探针悬臂或者楔形探针研究细胞力学性质的手段, 在Stewart等(2013, 2012)的一系列文献中有详细描述. 在此类型实验中, 细胞被限制在楔形的原子力显微镜悬臂和支撑细胞的基底这两个平行板之间.在这一狭小空间中, 细胞皮层张力和压力之间的相互作用可以通过拉普拉斯定律描述, 从而允许流变力学的测量. Strilić (2010)通过悬臂研究了位于内皮细胞表面的顶端糖蛋白的唾液酸, 证实在内皮细胞体系内产生排斥静电场.体外和体内实验都显示唾液酸的负电荷是分离内皮细胞表面和随后的内腔形成所必需的, 还表明硫酸盐残留物可以在管腔引发期间代替唾液酸.由于在腔细胞表面经常发现带负电荷的黏蛋白和蛋白聚糖, 结果揭示了在脊椎动物体内产生最丰富的导管血管的关键步骤, 静电排斥是启动其他器官中的腔形成的一般原理.细胞流变力学最典型的观察对象是细胞的有丝分裂过程(Cattin et al. 2015). 细胞的有丝分裂过程中, 通过局部调节肌动球蛋白--皮层依赖性表面张力和全局调节渗透压, 细胞可以控制其体积, 形状和机械性质(Stewart et al. 2011, Fischer-Friedrich et al. 2014, 2016).例如Ramanathan等(2015)描述了单个细胞有丝分裂过程中肌动球蛋白向细胞皮层聚集的过程.在有丝分裂开始后, F-肌动蛋白始终在皮质富集, 而肌球蛋白II逐渐积累于皮质, 皮层肌球蛋白的数量与细胞内的压力相关.F-肌动蛋白仅提供对机械变形的短期\((<10\) s)抗性, 肌球蛋白维持细胞内的压力抗性持续的时间会更长\((> 60\) s).

除了动物细胞外, 基于原子力显微镜技术的力谱技术也可以用于研究植物细胞(Milani et al. 2011). 不过, 植物细胞由于细胞壁的存在, 其力学模型要显著比动物细胞更为复杂. 细胞壁是细胞的外层, 在细胞膜的外面, 细胞壁本身结构疏松, 外界物质可通过细胞壁进入细胞中.植物细胞是一层比较硬的细胞壁包裹着带有膨压(细胞内的水分对细胞壁的压力)的细胞质, 是有内压的复杂壳体结构, 取决于来自膨压的内部驱动与细胞壁外部约束之间的微妙平衡.细胞壁的厚薄常常因为细胞所处组织、功能的不同而存在明显差异.如果细胞壁很厚且大致厚度已知时, 如果能控制压入深度在厚度的10%以内, 则力曲线能够得到细胞壁的杨氏模量. 如果知道细胞壁杨氏模量\(E\), 针尖下压位置及其附近的形貌图所反映的细胞几何外形, 细胞壁的弹性系数\(k\), 用电镜等辅助手段获取细胞壁的厚度\(t\), 则可以利用这一系列参数计算膨压的相关参数(Beauzamy et al. 2015).

3.4 复杂力谱及力学操纵

蛋白质的折叠结构对于许多生理功能的实现具有重要作用.基于原子力显微镜技术的单分子力谱是研究蛋白质分子内与分子间相互作用力, 进而揭示其结构功能及动态过程的新型表征技术.单个蛋白质分子的去折叠过程所提供的锯齿状力曲线, 以及不同外力加载速率下得到的动态力谱, 为进一步了解蛋白质折叠/去折叠机理提供的大量的信息. 但是, 随着单分子力谱技术的不断发展, 传统意义的原子力显微镜技术已经渐渐不能满足一些特定实验的要求.于是研究者们开始在显微镜的内部或外部的硬件/软件结构上加以改造, 从而提高实验技术的可操作性和多样性.选择通过旁路原子力显微镜器件自身的控制模块, 或者编写脚本软件, 以实现可由用户自定义的、可精确操纵的单分子拉伸实验技术.一般来说力谱相关实验所涉及的控制参数包括XYZ三轴方向的指定路线、停留时间、移动速度、偏置电压、采样率, 以及输出/记录的信号通道等.

应用复杂力谱对样品的力学操纵, 最早要追溯到Rief等(1997b)对肌联蛋白的往复拉伸实验. 研究表明, 通过往复拉伸的复杂力谱还可以从单分子水平捕捉到蛋白质的错误折叠信息.Oberhauser等(1999)发现, 在对含有重复I27结构域的蛋白质链进行往复拉伸时, 蛋白质会出现错误折叠. 当I27结构域被依次拉伸开, 然后松弛使其重新折叠时, 两个临近的结构域没有各自折叠回原来的空间结构, 而是折叠在一起, 形成了一个新的结构域, 在力曲线上表现为锯齿峰的缺失.这种错误的折叠会使蛋白质自身的长度变长, 但其力学稳定性却与正常折叠的结构域没有明显区别.往复拉伸的力谱实验还直接观察到铁硫蛋白红氧化还原蛋白(rubredoxin)的可逆去折叠反应(Zheng et al.2014). 在金属蛋白质中, 金属中心作为一系列功能目的的活性位点, 并且也是促进蛋白质折叠和组装的重要结构元件.由于金属中心的缺失或分解, 观察金属蛋白质的可逆去折叠和再折叠是具有挑战性的. 结果表明, 当氧化还原蛋白被拉伸时, 铁可以保持与CXXC基序连接. 外力放松后, 展开的氧化还原蛋白可以通过重构的FeS\(_{4}\)中心重新折叠成其天然的状态.这些结果表明, 在铁离子保持附着时氧化还原蛋白的去折叠是可逆的, 并提供了铁作为红氧化还原蛋白折叠过程的重要因素的实验证据.利用原子力显微镜超低漂移悬臂结合往复拉伸力谱设计, He等(2015)直接检测了\(\alpha /\beta \)蛋白质NuG2的折叠过程.在缓慢的拉速\((<50\) nm/s)下, 可以清楚地观察到NuG2的再折叠.降低拉伸速度降低了去折叠力和再折叠力之间的差异, 使原本不平衡的去折叠--再折叠反应过程达到接近平衡.在非常低的拉速(约2 nm/s)下, 观察到去折叠和再折叠在近平衡态下发生.通过测量NuG2的折叠状态和去折叠态之间的平衡自由能变化, 展示了探索其他机械重要的\(\alpha /\beta \)和全\(\beta\)折叠弹性蛋白质反应途径研究的新方法.

前文介绍的力钳模式也是复杂力谱中的一类, 它可以将施加在样品上的作用力控制在一个恒定值. 与此类似的, 有一种力梯度模式(froce ramp), 可以线性的改变施加在样品上的作用力.腱生蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白质, 在生理条件下经受拉伸力, 在调节细胞--基质相互作用中起重要作用. 在力梯度模式下, Wang等(2006)研究了重组腱生蛋白质片段TNfnALL的去折叠动力学过程.研究结果表明, TNfnALL中的所有15个FnIII结构域在无外力下具有相似的自发去折叠速率常数, 但是它们的折叠率常数却有着很大差异.力梯度模式作为力谱技术下的一个强大工具, 可以准确地定量表征去折叠和折叠反应的动力学参数.

通过力谱技术对单个膜蛋白的力学操纵, 可以观察其重新折叠回到膜中的动力学过程.液相中能够直接折叠回到膜中的一般是只有部分去折叠的小蛋白质, 例如紫膜中的视紫红质蛋白质和OmpG蛋白质. 图13显示了将膜内的视紫红质蛋白质拉伸后, 使其部分去折叠①, 再将其按压至膜层表面②, 之后再次拉伸至只有最后一个结构域仍镶嵌于膜内③, 再次按压回表面④, 最后将其完全从膜内拉出⑦的复杂力谱实验.通过对视紫红质蛋白质的精确力学操纵, 发现部分去折叠的小型膜蛋白按压于膜层表面时, 其可以直接再次折叠回到膜内(Kessler et al. 2006).类似的实验结果也被发现于跨膜\(\beta \)折叠蛋白质OmpG中(Damaghi et al. 2011).

图13   复杂力谱实验研究视紫红质蛋白去折叠及再折叠动力学过程(Kessler et al. 2006)

   

但是大体型的蛋白质通常由于结构过于复杂而并不会直接折叠回膜层内, 而是出现错误折叠的现象. 大肠杆菌外膜中最大的\(\beta\)折叠蛋白质之一的铁氧肟酸盐摄取受体(FhuA)的去折叠和再折叠实验中, 在外部机械应力下FhuA经历复杂的去折叠路径, 其中11个\(\beta\)折叠每个顺次展开直到整个\(\beta \)折叠桶状结构去折叠.然而去折叠后即使外力松弛, FhuA多肽也不能折回到脂质膜中而是采用各种错误折叠的构象(Thoma et al. 2012). 后续的研究结果表明, 更复杂的蛋白质需要辅以分子伴侣、转运体或者插入酶的帮助, 才会恰当地插入和折叠回到膜中. 当引入周质保持酶伴侣SurA和Skp后, 分子伴侣通过稳定去折叠态的FhuA来防止其错误折叠, 从而允许其搜索再折叠所需的中间态构象.期间SurA伴随的FhuA多肽逐个将\(\beta \)折叠插入膜中, 直到\(\beta\)桶状结构折叠回膜层(Thoma et al. 2015).在复杂力谱观察跨膜分子伴侣和插入酶YidC对\(\alpha\)螺旋膜蛋白乳糖通透酶(LacY)的折叠轨迹影响的实验中发现, 在没有YidC的情况下, 受外力去折叠的LacY能将个别单独的结构片段插入膜中, 但是错误折叠主导了该过程, 使得折叠不能完成.而引入YidC后可以通过保持去折叠状态的稳定来防止LacY错误折叠, LacY能够将结构段逐步插入到膜中, 直到折叠完成. 在逐步插入期间, YidC和膜层一起稳定了折叠中间态. 值得注意的是, 结构片段的插入顺序是随机的, 表明LacY可以沿着可变路径向天然结构折叠(Serdiuk et al. 2016).

在涉及到DNA的复杂力谱力学操纵实验中, 可以利用互补单链DNA之间会形成DNA双螺旋的特点, 将单个目标分子剪切并黏贴到特定的位置, 与传统方法相比将定位精度显著提高到纳米量级(Heucke et al. 2014).此外, 通过使用表面电位循环技术结合力学操纵, 可以将原子力显微镜尖端的单分子DNA沉积在裸金电极上(Erdmann et al. 2010). 应用抗体和抗原肽标签, 单分子黏贴技术可以处理单一蛋白质.蛋白质--DNA复合物可以排列成复杂的样式, 同时保持蛋白质部分的功能.这种用于蛋白质排列的定向组装的单分子方法, 使得基于蛋白质组分的受控系统构建成为可能(Strackharn et al. 2012).经单分子力谱剪切进行的表面组装, 还可以用纳米级精度实时监测该过程.通过全内反射荧光显微镜和原子力显微镜的组合, 可以观察到纳米尺度图案沉积的单个荧光团(Kufer et al. 2009).虽然图案的光学分辨率远低于显微镜, 但可以通过将结合位点定位, 并检测荧光团的光漂白来识别各个染料. 通过这种方法的组合, 可以随意布置单独的染料标记的生物分子以用于特定功能, 例如偶联的荧光团系统或定制的酶级联, 同时辅以纳米级精度的实时监测.

除此以外, 通过基于力谱技术的原子力显微镜设备, 可以精确控制悬臂梁和探针在样品上移动轨迹和所施加的作用力.再加上可以选择具有不同物理性质的探针, 如镀有铂、金、钛等导电层或者镀有类金刚石耐磨层, 辅以施加在探针或样品上的电压, 还可以进行刻蚀和操纵实验等(Pires et al. 2010). 既可以应用于如图14所示的金属或半导体基底, 也可以用于生物样品表面的刻蚀和特定结构刻画(Liu et al. 2004, Paul et al.2011). 对基于原子力显微镜的力学操纵和刻蚀技术, Garcia等(2014)的综述文献中进行了详细报道.

图14   原子力显微镜进行的纳米表面氧化刻蚀图样, 每幅小图实际尺寸2 \(\mu \)m \(\times \) 2 \(\mu \)m, 纵向起伏约2 \(\sim \) 5 nm(NT-MDT公司)

   

4 力谱技术研究配对目标对象的应用

基于原子力显微镜的力谱技术除了研究单独样品的力学性质之外, 还可以研究配对目标样品的相互作用, 包括了从核酸、小分子、蛋白质到细菌、病毒、细胞等一系列样品与其他目标的相互做用.研究配对目标相互作用时, 常见的方法是将其中一个目标桥连到探针或悬臂梁上, 将另一个目标桥连到基底上, 之后通过让针尖与基底接触后分离, 直接测得两者的相互作用强度. 在桥连/修饰过程中, 需要通过控制固定在针尖和基底上的目标样品密度, 使针尖和样品的有效接触面积内最多只有一对分子形成复合物, 通过统计所测力值分布的最可几值, 直接得到单分子力, 这也是目前在单分子力谱研究中应用最为广泛的方法.由于并不是每次都能在力--距离曲线上检测到特异作用力, 而是仅有一定的成键几率(此几率随特定样品有很大差异, 从0.1%至10%都有可能). 为了获得用于统计的力值分布图, 往往实验过程中需要经过上千次的反复提拉(Horton et al. 2002).在本章节中, 按照修饰在针尖上的物体为分类, 研究了核酸小分子、蛋白质、细胞与其他目标的力谱研究.

4.1 核酸及小分子与其他目标的相互作用

DNA与其他分子的相互作用一直是研究的热点. 在基础研究领域, 基因的复制、转录及染色体的形成都包含着DNA与蛋白质的相互作用, 因此相互作用的研究对揭示生命活动过程的机理有着重要意义.而在药物研发领域, 筛选出能够与特定的DNA序列相互作用的小分子, 对疾病的预防与治疗也是极为重要的. 近年来, 研究人员利用力谱方法将DNA修饰在探针上, 直接研究DNA与其他分子的作用机理.

核酸本身的双螺旋结构即可作为配对目标的一种典型研究.通过将单链DNA修饰在原子力显微镜的针尖, 对其与互补DNA单链的相互作用展开了一系列研究(Moy et al. 1995).检测出双链DNA的解链作用力大小为每10碱基对10 \(\sim\) 20 pN(Krautbauer et al. 2003).通过对两个30碱基的寡核苷酸双链体组成的分子力平衡的实验, 给出了一种能够以设定的外力和加载速率模拟力诱导下的断裂模型.并用DNA双链两端双键的断裂位点进行了预测(Neuert et al. 2007).核酸正在越来越多地作为纳米尺度结构的可编程构建块.通过特定DNA碱基对识别进行自组装, 可以形成各种特异性结构.这些结构的稳定化可以通过与取代碱基的金属配位键来实现.在携带水杨醛核苷的双链DNA在铜金属络合时的力学转换研究中, 发现断键力增大了两倍. 动力学分析表明在外力加载速率较高时, 此生物分子杂交体的力学性质主要受局域配位键的影响, 而在外力加载速率较低时, 目标的稳定性主要受碱基对相互结合的影响(Gaub et al. 2009).

核酸与蛋白质的相互作用贯穿于分子生物学中心法则的每一个环节, 核酸和蛋白质分子的特定相互作用在分子生物学中起着关键作用.蛋白质与核酸结合的精确定位和不同细胞状态下结合位点的测定对于了解复杂细胞体系的功能与机理, 特别是基因表达的控制都十分关键.在单分子水平对这些蛋白质与核酸的作用机理以及相互作用的影响因素的研究, 有助于深化人们对DNA复制等重要生命过程发生的分子机理的认识, 从而最终实现对DNA复制等过程的人为调控奠定基础.在枯草芽孢杆菌单链DNA结合蛋白(BsSSB)和单链DNA(ssDNA)之间的相互作用研究中(Zhang et al.2011), 发现BsSSB与ssDNA的高摩尔比可以产生以两个蛋白质结合一个65-nt(核苷酸)ssDNA的模式形成的BsSSB-ssDNA复合物, 而低摩尔比便于以一个蛋白质结合一个65-ntssDNA的模式形成BsSSB-ssDNA复合物, 两种结合模式处于动态平衡状态.通过使用单分子力谱技术, 在不同盐浓度的溶液中对BsSSB-ssDNA复合物的断裂力进行了定量测定.结果表明, 在高盐浓度下断裂力强度比低盐浓度高约10 pN, 而高盐浓度下BsSSB-ssDNA复合物的寿命是低盐浓度的两倍, 说明在高盐浓度下可以形成更高结合强度的BsSSB-ssDNA复合物.在对不同的小槽黏合剂和嵌入剂对机械应力下单个DNA分子的机械性能的影响实验中, 发现小分子的结合显着改变了DNA的力学性能, 并比较了不同结合模式和浓度对其的影响.发现观察到的过度拉伸形成的平台力值和平台宽度, 与每种药物存在下DNA熔融实验中记录的温度和温度范围相关, 这说明纺锤菌素(netropsin)与DNA的小沟槽结合后, DNA的双螺旋结构变得更加稳定(Krautbauer et al. 2002a).Krasnoslobodtsev等(2007)研究了DNA限制性内切酶SfiI与双链DNA复合物的单分子力谱, 推测SfiI与双链DNA结合形成能瞬间分离的动态复合物.SfiI特异识别的DNA序列中有一段间隔序列, 它不与SfiI结合, 但其序列的改变却能改变蛋白质/DNA复合物的解离速度, 从而影响SfiI酶的切割速度.

除DNA外, 利用单分子力谱技术对核酸适配体(aptamer)的研究也有报道.核酸适配体是从体外筛选得到的一类寡聚DNA 或RNA 分子, 它的功能与抗体相似, 均能与配体高效、专一地结合, 同时具有抗体无法比拟的诸多优势, 如结合靶分子的范围广泛、核酸适配体的特异性和亲和力均比抗体高、分子质量小、体外合成简单、可进行多种化学修饰且无免疫原性等.核酸适配体在生物和医药领域应用比较广泛的是对靶物质的检测与分析, 通过将荧光试剂等各种报告基团定点标记在核酸适配体上, 在一定条件下核酸适配体能够与靶物质发生相互作用, 通过检测报告基团的信号, 实现对靶物质的检测与分析.为了研究合成的核酸适配体是否能像天然抗体那样与相应配体牢固结合, O'Donoghue等(2012)从生物物理学角度利用单分子力谱技术研究了人宫颈癌细胞表面的PTK7(蛋白质酪氨酸激酶)与其适配体, 以及与其抗体之间的特异性相互作用.测得HeLa细胞表面PTK7与其适配体sgc8之间的解离力大小为(46 \(\pm\) 26) pN, 与其抗体之间的解离力大小为(68 \(\pm \) 33) pN.通过此实验得知, PTK7 与其适配体sgc8c 和抗体之间的解离力很相近, 且为适配体与其配体相互作用的检测提供了新方法, 为适配体的筛选和开发提供了定量研究的有效手段.

单分子力谱可以实现在生理条件下研究活细胞表面的生物分子, 从而进一步了解这些生物分子的生理功能, 这在生物细胞学的研究中具有重要意义.通过功能化的原子力针尖也可以修饰包括多糖、肽链等生物小分子, 之后用于检测不同的细胞表面蛋白质.Zhao等(2013)分别研究了癌细胞和正常细胞表面葡萄糖与外源凝集素WGA、甘露糖与外源凝集素PMA的相互作用, 发现外源凝集素与癌细胞表面多糖形成的复合物稳定性较差, 并通过动态力学谱分别计算了各复合物的解离能.之后该研究组又继续以子宫颈癌HeLa细胞为研究对象, 探究了\(\alpha\)-螺旋的单个抗癌多肽及其类似物与细胞膜的相互作用(见图15).结果发现, 这种作用的强弱由多肽的疏水性决定(Shan et al. 2012).Puntheeranurak等(2007)将葡萄糖共价修饰在针尖上, 通过单分子力谱研究葡萄糖与仓鼠卵巢细胞表面葡萄糖转运蛋白(SGLT1)的相互作用, 发现SGLT1对葡萄糖具有专一的识别作用, 且葡萄糖与SGLT1结合具有钠离子依赖性.同时还发现葡萄糖的立体构象对SGLT1的识别具有一定的影响, 当C1位存在较大的取代基团时, C2位去羟基葡萄糖不影响结合反应; 而当C1位不存在较大的取代基团时, C2位去羟基葡萄糖会影响结合反应.在使用单分子力谱研究活体CHOK1细胞中血清素转运蛋白与MFZ2-12分子(强力可卡因类似物)之间的相互作用实验中(Wildling et al. 2012), 首先将MFZ2-12通过交联剂固定在探针末端. 通过改变拉伸速度, 药物--转运蛋白复合物在不同的外力载荷下断裂, 从而反映相互作用的能量. 从这些记录中得到的化学速率常数, 使研究者对血清素转运蛋白和抑制剂之间相互作用的能量形态有了新的认识, 为在反应期间分子动力学模拟提供了作用力和能量范围的有效框架.外源分子与活细胞表面的某些位点特异性相互作用后, 可以激活细胞里的信号通路, 这种相互作用的研究对于信号通路激活机制的了解具有重要的作用.例如TLQP-21多肽可以引发解脂功能, 因而对肥胖症有很好的抑制效果, 而且还可激活细胞中的钙离子流动.Cassina等(2013)将TLQP-21多肽修饰到针尖之上, 首次探究了其与CHO细胞上受体的特异性相互作用.

图15   将各种小分子修饰于针尖后研究其与配对目标的相互作用. (a)葡萄糖(Puntheeranurak et al. 2007), (b) 抗癌多肽(Shan et al. 2012), (c) MFZ2-12分子(Wildling et al. 2012), (d)聚环氧乙烷(Sonnenberg et al. 2007b)

   

单分子力谱利用经小分子修饰的探针, 在研究细菌表面结构与组成方面也取得了一系列进展.Gilbert等(2007)将万古霉素共价连接在针尖上, 通过单分子力谱研究万古霉素与乳酸乳球菌细胞壁肽聚糖组分末端D-Ala-D-Ala位点的特异性结合, 测得二者的相互作用力约为98 pN, 并计算出结合速率常数及分解速率常数, 同时表征了肽聚糖在乳酸乳球菌表面的分布.研究结果为探索抗生素结合机制和细菌细胞壁的结构提供了新的依据.此外, Francius等(2008)将凝集素修饰在针尖上, 通过单分子力谱研究凝集素与鼠李糖乳杆菌表面分布的半乳糖和甘露糖的相互作用, 测得野生型菌的多糖属性(分布、黏附和扩展)与突变株存在显著差异.这为探索细菌表面多糖的多样性和了解它们在生物组成方面的作用有重要的意义.念珠菌属作为真菌界酵母科条件致病菌, 免疫系统受损的患者很容易被此致病菌严重侵染. 在真菌侵染过中, 菌体细胞壁多糖是免疫细胞受体识别的主要靶点.由于各菌体的细胞壁组分以及相应宿主受体的不同, 可以引发多种特异性宿主炎症反应.为了深入理解真菌细胞壁多种糖类分子的识别机制、种类多样性及其在菌体表面的分布情况, El-Kirat-Chatel等(2013)利用单分子力谱技术对酵母科菌体表面的多种糖类分子进行了研究, 将相应的抗体和外源凝集素修饰到针尖上.力谱实验表明两种致病菌(白色念珠菌和平滑念珠菌)的\(\beta\)-葡聚糖的拉伸长度均强于非致病菌酿酒酵母, 这可能是引起不同菌体细胞壁纳米力学特性不同的原因, 可能在加强菌体细胞壁力学性能和影响细胞的免疫识别方面发挥着重要作用(Mora-Montes et al.2011).

除了天然生物分子外, 一些人工小分子也被应用于力谱技术的研究, 例如Beaussart等(2016)制备了有10个碳水化合物配体和硫醇键的新型富勒烯基甘露糖缀合物, 用于直接定量测量活细菌上的抗黏附化合物的活性.对多种抗生素耐药的细菌菌株的发展, 促使人们需要新的抗菌治疗方法, 防治细菌性疾病的一种有效方法是使用能够阻止病原体黏附于宿主组织的抗黏连剂, 这也是感染的第一步. 人造的富勒烯甘露糖具有硫醇官能团, 可以方便地连接探针尖端. 使用单分子和单细胞力谱测定的组合, 结果表明与甘露糖苷单体不同, 富勒烯甘露糖明显阻断了致病性大肠杆菌细菌对其碳水化合物受体的黏附.这为将纳米技术用于设计新的抗黏连药物来治疗微生物感染开辟了新的思路.

在小分子配对目标的力谱研究中, 也可以将非生物样品作为配对的目标, 研究其与小分子的相互作用. 例如为实现芘及其衍生物与石墨表面的\(\pi\)键相互作用的直接测量, Zhang等(2007)将单个芘分子通过柔性聚乙二醇链(PEG)连接到针尖上, 研究了芘分子与石墨表面的相互作用.动态力谱的结果并没有非常明显的速率依赖性, 说明该相互作用力是在准平衡态下进行的, 此时所测量的脱附作用力等于吸附作用力.利用类似的方法可以研究各种不同共轭结构的分子和石墨之间的相互作用, 逐步建立\(\pi \)键相互作用与共轭结构间的关联, 可能用来指导基于\(\pi \)键相互作用诱导的自组装.Sonnenberg等(2007b)将人工合成的聚环氧乙烷(PEO)和聚L -谷氨酸(PLE)的嵌段共聚物共价连接到针尖的末端, 用以研究其与方解石晶体间的相互作用.实验过程中首先将小分子充分吸附在方解石晶面上, 之后以高精度检测两者脱离时的断裂力.考虑到在生物矿物中的结晶过程中的重要性, 实验同时研究了PLE与方解石相互作用力与pH值以及水溶液的钙浓度的相互关系.实验结果检测到了PLE与方解石(104)和方解石(100)之间相互作用力的差异.

4.2 修饰在针尖的蛋白质与其他物质相互作用

在力谱技术研究配对样品的实验设计中, 开展最广泛的实验设计是将蛋白质修饰到原子力显微镜的探针上, 然后研究其与核酸、其他蛋白质、细胞上的受体等其他物质的相互作用.力谱技术在此配置下一般用以检测配体--受体对的结合强度, 首先将受体或配体连接到探针, 而将同源配体或受体连接到基底.将探针接近基底后可以形成配体--受体结合, 之后随着探针的回退迫使结合断裂. 在此过程中受体--配体键的强度, 可以从所记录的力--距离曲线中推断出来.基于原子力显微镜的力谱技术已成为表征生物分子间相互作用的重要的分析方法, 广泛用于研究抗原--抗体、受体--配体、蛋白质--蛋白质和蛋白质-DNA等的相互作用.

1994年Florin等通过牛血清白蛋白将亲和素分子连接到AFM 针尖, 在覆盖了生物素分子的琼脂糖珠上测量了单对生物素--亲和素之间的相互作用力(160 \(\pm\) 20) pN. Hinterdorfer等(1996)研究了蛋白抗体与抗原的相互作用力, 并改进了蛋白质的固定方法, 通过一段PEG高分子聚合物链将蛋白质与表面相连, 这样不仅增加了抗体抗原的空间自由度, 而且能从力--距离曲线图上将其特异性相互作用与针尖和基底的非特异性相互作用力区分开来, 成为目前固定蛋白质的常用方法.在覆盖有抗原分子(人血清白蛋白)的云母表面测量了单对抗体-抗原之间的相互作用力(244 \(\pm\) 22) pN.将提纯的蛋白质分子吸附到平整基底进行分子力测量的优点是消除了细胞表面(如细胞形貌, 细胞膜的柔软动态特性)对蛋白质分子的影响, 从而显著提高了信噪比, 并且可通过对蛋白质分子同时进行形貌成像和分子力测量来证明检测结果的准确性, 因而提高了实验结果的可信度(Wang H et al. 2008).通过将提纯的蛋白质分子吸附到基底, 研究人员测量了不同类型蛋白质分子之间的相互作用力, 如铁蛋白(ferritin) (Allen et al. 1997)、钙黏蛋白(cadherin)(Baumgartner et al. 2000)、路易斯寡糖(sLeX)-选择素(selectin)(Zhang X et al. 2004)、Strep-Tactin与绿色荧光蛋白等(Baumann et al. 2016).

随着研究领域的深入, 人们意识到测量不同分离速度(即加载速率)的断裂力提供了关于结合键的动力学性质的信息(Moy et al.1994).结合键的动力学模型分析可以用于估计配体--受体键的热力学和动力学性质(Evans & Calderwood 2007, Dudko et al. 2008, Friddle et al. 2012).这些性质包括跨越折叠状态的能量势垒\(\Delta G_{0}^\ddag \); 活化态到结合态的距离\(x_{\rm u}\); 不施加外力平衡态条件下的复合物解离速率常数\(k_{\rm off}(0)\); 此外结合键的寿命也可以通过使键处于低恒定力并等待键的断裂来测量(Woodside & Block 2014, Perez-Jimenez et al. 2011).此恒定作用力可以通过原子力显微镜的反馈系统以力钳模式施加(Oberhauser et al.2001, Stahl et al. 2009), 也可以利用天然的细胞膜栓系Tether来实现(Krieg et al. 2008b).

修饰在针尖上的蛋白质还可以用于研究与配对DNA的相互作用.了解转录因子与其DNA元件的相互作用是研究基因表达和调控的基础.为了探讨基于AFM 的单分子力谱方法在药物筛选方面应用的可行性, Zhang等(2005)优化了DNA的固定方法.通过聚合酶链式反应(PCR)方法将双螺旋DNA的末端分别进行巯基和生物素(Biotin)标记, 然后通过巯基与金之间的键合作用将DNA固定在金片表面. 同时对AFM针尖也进行生物素及链霉菌抗生素蛋白(streptavidin)修饰, 最后在力谱实验时依靠针尖上的抗生素蛋白与DNA末端的生物素之间的特异性识别作用实现对DNA链的可控拉伸. 采用这种改进的实验方法, 不论是在提高实验的可重复性还是降低DNA样品的破坏程度等方面都得到了很大改善.Jiang等(2004)建立了利用单分子力谱研究转录因子与DNA启动子相互作用的方法, 并应用于检测多种新发现的植物转录因子与其DNA元件DRE和ERE的结合, 结果表明AFM在测定转录因子与其DNA启动子作用力方面具有很高的灵敏度: 转录因子DNA结合域中单个关键氨基酸的突变或者启动子核心序列中单个碱基被其他碱基取代, 使得两者的结合力和结合几率大大减弱. 基于力谱技术, 通过探测与基底结合的分子和携带互补结合配体的针尖之间的相互作用, 提供了对生物分子的结构和动力学的见解.Zhu等(2010)用结合了抗体的原子力显微镜探针, 以0.4 nm的分辨率测量了单个DNA链中的5-甲基胞苷碱基之间的距离, 从而揭示了DNA甲基化模式, 这在基因表达的表观遗传控制中具有重要作用.针尖上的抗体能够结合固定在基底上的DNA链的两个5 -甲基胞苷碱基, 并且力曲线上的独特的锯齿峰型反映了两个标记碱基之间的间隔.这种纳米机械方法还可以在单分子水平上检测生物聚合物中类似的化学模式.

单分子力谱还被用于研究蛋白质与适配体(aptamer)的相互作用, jiang等(2003)将免疫球蛋白IgE和适配体分别共价连接在针尖和基底上, 用单分子力谱研究了IgE和适配体间的特异相互作用, 得到适配体与蛋白质间的相互作用力约为159 pN, 该值与抗体与抗原间的相互作用力相近(Yu et al. 2007a). 如图16所示, 笔者研究了结合在修饰在针尖上的凝血酶蛋白, 与修饰在基底上的二价适配体之间的相互作用.数据显示二价适配体与凝血酶蛋白之间的结合具有更高的稳定性和更加明确的选择性.在实验中使用了与凝血酶蛋白特异性结合的两类单体适配体15 apt及27 apt, 两者之间由8 -亚磷酰胺间隔链连接.通过对比缓冲液中单独或同时引入两类适配体, 发现27 apt与凝血酶的结合不受间隔链的影响, 而15 apt与凝血酶的结合由于间隔链的存在而显著提高了结合的稳定性(Ge et al.2012).

图16   凝血酶蛋白与二价适配体之间的相互作用(Ge et al. 2012)

   

细胞是生物体基本的结构和功能单位, 细胞膜表面分布着多种特异性结合位点, 因此涉及复杂的生物大分子间相互作用, 如膜表面受体蛋白质与相应配体、碳水化合物与外源凝集素、抗体与抗原及细胞黏附分子与胞外基质等.由于提纯的蛋白质分子通常仅包括细胞外结构域, 而有些受体分子需要通过与细胞质因子进行反应来调节其生理活动(Helenius et al.2008), 且脱离了细胞环境的蛋白质分子未必能完全反应细胞膜上蛋白质分子的真实行为特性.因此, 通过将细胞吸附到基底(如载玻片, 培养皿), 直接对细胞表面的膜蛋白进行原位状态下的力谱实验, 可以更好地理解细胞分子生理活动.

Lehenkari和Horton(1999)用PEG交联链将精氨酸--甘氨酸--天冬氨酸(RGD)配体修饰在针尖上, 测量该配体和细胞表面整联蛋白之间的相互作用, 通过单分子力谱测得了解离力为32 \(\sim \) 97 pN, 发现细胞培养基中, pH值及二价阳离子影响整联蛋白和RGD的特异性相互作用.Madl等(2006)采用荧光显微镜与AFM相结合的方法, 利用荧光显微镜准确地定位了带有荧光标记的受体聚集体, 并将修饰了配体的针尖移动到聚集体上, 研究了配体与受体相互作用的特异性, 两种技术的结合极大地提高了实验的效率和准确性. Yu等(2007)测量了活细胞表面的转化生长因子\(\beta \)1(TGF-\(\beta \)1)与其受体之间的作用力, 发现共表达T\(\beta \)RI 和T\(\beta \)RII会增强TGF-\(\beta \)1与其受体之间的结合力. Shi等(2009)在HEK293细胞上研究了Heregulin与人表皮生长因子受体(HER)之间的特异性相互作用, 发现同时表达HER2和HER3的细胞与Heregulin之间的结合力要大于仅表达HER3的细胞与Heregulin之间的结合力, 而在加入Herceptin 后会导致Heregulin与HER之间的结合力减弱.Carvalho等(2010)通过将纤维蛋白原连接到AFM针尖对红细胞进行单分子力谱研究, 发现红细胞表面存在有一种纤维蛋白原受体, 该受体与纤维蛋白原之间的结合力约为79 pN.钩端螺旋体病是一种由致病的钩端螺旋体引起的肾脏疾病, 其表面膜蛋白LipL32在识别宿主细胞方面起着关键作用.Hsu等(2010)将蛋白LipL32修饰到针尖上, 确定了TLR2是LipL32主要进攻的目标分子而TLR4不是LipL32的受体. Zhang等(2012)将促黄体激素释放激素(LHRH)连接到AFM针尖, 在HeLa活细胞表面研究了LHRH与其受体之间的特异性结合作用. Li等(2013)在人胶质瘤细胞(U251)表面研究了胞外基质蛋白Tenascin-C与核酸适体GBI-10之间的特异性作用, 测定了Tenascin-C与GBI-10的结合力和解离常数.Zhao等(2013)对癌细胞与正常细胞表面上的葡萄糖和外源凝集素WGA之间以及甘露糖和外源凝集素PMA之间的相互作用进行了研究, 利用动态力学谱对各个复合物的解离能分别进行了计算. 结果显示, 癌细胞表面多糖与外源凝集素结合成的复合物稳定度较低.在解偶联蛋白家族中, UCP1具有介导质子传输的作用, 而带有嘌呤核苷酸的ATP 具有抑制质子传输的作用.Zhu等(2013)对二者之间的相互作用进行了研究, 确定了核酸结合位点在UCP1上的位置, 且具有很高的识别精度, 能够达到0.1 nm. 除了蛋白质之外, 表面结合的多糖也有着许多重要的功能, 例如, 保护细胞抵御不利的环境条件, 介导细胞识别以及促进生物组成等.单分子力谱也可探测和分析细胞表面的多糖. Li等(2011)通过用单分子力谱探测了蓖麻凝集素Lactin(RCA120)与细胞表面糖的相互作用, 发现凝集素特异识别HeLa细胞表面\(\beta \)半乳糖残基, 其相互作用力为43 pN. LeCigne等(2016)研究了低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP-1)对癌细胞侵袭性参数的影响.结果表明, LRP-1灭活诱导细胞黏附行为的变化, 特别是细胞附着的动力学.通过AFM测定细胞的机械性能表明, 这些差异与杨氏模量的增加相关, 还观察到经LRP-1灭活的细胞与明胶颗粒之间的黏附力增大.

力谱技术还可以研究多种菌体表面的不同种类的蛋白质和糖类分子.细菌和真菌表面的黏附蛋白和多糖及糖类衍生物结构与功能均十分复杂, 它们参与菌体细胞多种生命活动过程, 如保护菌体免受外界不利环境条件的影响、介导菌体病原体与宿主细胞的相互作用、促进菌体在活体表面黏附及生物膜形成等.

结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原菌, 它可以侵染全身各组织器官, 以肺部结核感染尤为多见, 已受到人们的广泛关注. 而肝素结合血凝黏附素(heparin-binding haemagglutinin adhesin, HBHA)是结核分枝杆菌的一种表面蛋白质, 它作为结合分枝杆菌的重要致病因子和黏附因子, 在细菌侵染和黏附过程中起着重要作用.Dupres等(2005)利用力谱技术将肝素(heparin)连接到探针上, 首次探测了结核杆菌表面的HBHA 与肝素之间的黏附力大小. 结果表明: HBHA单体与肝素之间的结合力在50 pN左右, 对应的117 pN的作用力是肝素同时与两个单体HBHA分子或与一个二聚体HBHA分子发生分子间相互作用所致, 并且HBHA与肝素之间的黏附力及黏附频率在一定接触时间范围内随着作用时间的增加而逐渐递增, 说明接触时间的延长有利于HBHA与肝素分子构象发生适当改变达到最优结合状态.

Qiao等(2012)通过体外使用单分子力谱研究了孢子外壳形态发生蛋白SpoIVA, SpoVID和SafA之间的直接的、非共价低亲和力的相互作用.枯草芽孢杆菌在外部环境不适合营养生长时, 可以形成休眠型孢子.孢子被称为孢子涂层的多层蛋白质壳包围, 其在休眠和发芽中起关键作用.在形成孢子涂层的70多种蛋白质中, 只有其中一小部分影响其形态发生, 它们被称为形态发生蛋白质.阐明单个蛋白质到这种复杂结构的自组装机制可能有助于其在纳米生物技术应用中的潜在用途, 用于制备高度组织, 稳定和抗性的蛋白质层.基于实时检测这三种蛋白质之间的相互作用, 得到一系列动态动力学数据.还观察到SafA-SpoVID相互作用强于SafA-SpoIVA.

Alsteens等(2010)利用力谱技术对真菌表面Als5p黏附蛋白质的特性做了探索性研究.该研究说明, 外力诱导引起黏附蛋白质群集可能是激活细胞黏附性的一个重要机制.Sasuga等(2012)研究了粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)的信息素(P-factor)及其对应的细胞表面受体Mam2之间的相互作用.将信息素连接到功能化的针尖表面, 在加载速度为1.74 \(\mu \)m/s条件下, 测得两者之间作用力为120 pN.Mam2是一种重要的G蛋白偶联受体(GPCRs), Mam2 与信息素的相互作用在粟酒裂殖酵母形成合子过程中具有重要信息介导作用, 因此该研究为认识GPCRs介导的信号传导过程提供了新思路.

4.3 修饰在针尖的细胞与其他物质的相互作用

将细胞修饰到针尖上之后的力谱实验, 主要目的是量化细胞黏附到界面的相互作用力.因为针尖上特异性的悬挂了单个细胞, 也称为单细胞力谱.单细胞力谱测量单个细胞对生物界面的黏附, 此处的生物界面可以是生物组织、另一个细胞、特定材料基底, 或用配体功能化的表面. 在大多数情况下, 单细胞力谱使用与现代光学显微镜兼容的原子力显微镜, 并且在与哺乳动物细胞或细菌的相关生理条件下实行.为了将单个细胞连接到悬臂的针尖或者无针尖悬臂梁, 悬臂可以用带电或疏水的聚合物功能化(如聚乙烯亚胺, 聚l赖氨酸或聚多巴胺), 或者用与细胞表面糖基结合的受体功能化(如刀豆素A) (Friedrichs et al. 2013, 2010a). 在光学显微镜的引导下, 功能化的悬臂被移动到细胞上方, 并下压与细胞充分接触, 使其容易附着在悬臂上. 此后, 探针单元与目标生物界面接触, 设定接触时间和力, 然后回退的同时记录力--距离曲线.此时对力曲线的分析提供了细胞的黏附力, 该黏附力在细胞与界面分离时以非连续台阶的方式快速衰减.这些步骤描述了在细胞表面受体和配体之间形成的键的破裂.图17所示为单细胞力谱的典型实验构架及典型力曲线.

图17   单细胞力谱的典型实验构架及典型力曲线(Helenius et al. 2008)

   

细胞与基底的相互作用是一类广泛的研究范围.细胞可以吸附到钢、铝、铜等金属基底表面, 从而自发地形成一种生物膜.使用单细胞力谱技术, 可以将细胞修饰到针尖上定量地研究细胞与基底的相互作用, 从而推断出细胞对吸附基底的选择性.Sheng等(2007)发现厌氧硫酸盐还原细菌在铝基底表面的吸附力最大, 而在铜基底上最小. Zhang 等(2011)研究了基底上细胞的横向解离力.发现对于大肠杆菌, 在不锈钢基底上解离力为(0.763 \(\pm\) 0.167) nN, 在聚左旋赖氨酸覆盖的玻璃基底上解离力为(0.639 \(\pm\) 0.136) nN.Whitehead等(2006)发现细胞形状在解离过程中起着重要的作用, 呈球状的金黄色葡萄球菌在光滑基底更易解离, 而杆状的绿脓杆菌在粗糙基底更易解离.

细胞与其他生物界面基底相互作用, 也是研究比较广泛的一个应用领域.Ulrich等(2005)通过研究斑马鱼肠胃祖细胞的中胚层和内胚层黏附力的变化, 解释了Wnt11发挥其作用的细胞机制. 结果表明, Wnt11通过调节E-钙黏蛋白介导的细胞内聚力通过Rab5c控制组织形态发生, Rab5c是一种在胃肠中Wnt信号传导的新机制. Te Riet等(2014)结合单细胞力谱与全内反射荧光显微镜, 研究了树突状细胞(DC)上的活化白细胞细胞黏附分子(ALCAM)和T细胞上的CD6分子调控的细胞黏附.通过衔接蛋白将ALCAM连接到肌动蛋白皮质, 使得皮质变硬并增强了细胞黏附.纲领性的提出了ALCAM如何有助于DC-T细胞黏附、稳定DC-T细胞接触, 并在CD6和肌动蛋白皮质之间形成机械连接以增强免疫突触细胞黏附.因为细胞黏附到悬臂上, 所以该技术也可以用于研究细胞表面的受体如何影响细胞来引发和加强对另一底物的黏附.Friedrichs等(2010b)开发了受激单细胞力谱分析. 在该测定中, 观测细胞对第一个底物的黏附, 对其与第二底物的黏附强度的影响.该测定定量给出了细胞的黏附和特异性黏附受体的贡献.

单细胞力谱除了针对动物细胞建立了各种分析方法, 也逐渐发展将该方法应用于单个细菌细胞.Beaussart等(2013)提出了使用胶体探针悬臂和生物素多聚多巴胺湿黏合剂的样品修饰方法, 用聚多巴胺涂覆的胶体探针黏附益生菌种植乳酸杆菌的活细胞, 使操作者能够量化单细菌和生物(凝集素单层)或非生物(疏水单层)表面之间的黏附力, 提供了研究益生菌和致病菌细胞黏附分子机制的通用平台.Alsteens等(2013b)使用单细胞力谱来量化了参与酵母菌丝黏附的作用力, 重点关注作为细胞黏附分子原型的Al(凝集素样序列)蛋白质的作用.结果显示单个酵母和菌丝细胞之间的黏附涉及强短程内聚相互作用((1.1 \(\pm\) 0.2) nN; (86 \(\pm \) 33) nm), 和弱远程栓系相互作用((0.4 \(\pm \) 0.2) nN; (234 \(\pm\) 81) nm). 对照实验表明, 这些相互作用源于对白色念珠菌特异性的细胞表面蛋白质.该结果代表了相互作用的真菌细胞之间黏附力的直接、无创测量, 并提供了真菌生物膜内聚强度的分子起源的新见解.受机械力影响而变化的细胞形态, 可以通过共聚焦或旋转圆盘共焦显微镜在三维空间内很好地观察到.所以Chaudhuri等(2009)开发了用于侧视图成像的不同解决方案, 允许从侧方空间直接观察悬臂, 细胞和底物.

细胞间的黏附作用在许多不同的生命形式中起重要作用, 如细胞分裂后的球体间黏附作用、连续的胚胎发育、单个细胞的运动、病原体侵入机体、免疫应答、肿瘤细胞侵入等生物学过程.Dammer (1995)利用AFM测定了海藻细胞的黏着力. 在生理环境中, 细胞间的黏附力可达400 pN, 这种强结合力可能正是形成多细胞海藻有机体完整性的基础.Kim等(2003)用光镜和原子力显微镜对鼠成骨细胞间的黏附力作用进行了定性与定量研究.Thie等(1998)用AFM研究了人子宫内皮细胞系(HEC-1-A, RL95-2)和人滋养型细胞(JAR)之间的黏附作用.他们将JAR功能性地结合在AFM扫描探针的尖端, 然后与单层的子宫内皮细胞层作用不同的时长, 观察其黏附力的变化.这项研究界定了滋养细胞和子宫内皮细胞间的相互作用.

细胞黏附过程中发生的胞间黏附和变化研究可用于发现病变过程是否主要依赖于黏附和它的控制.免疫系统中的细胞既要像非黏附细胞那样在血液和淋巴中循环, 又要像黏附细胞那样在组织间移动.白血球、内皮细胞表面存在的黏附分子不仅控制着胞间相互作用, 而且在细胞迁移调节过程中起重要作用.肿瘤侵染和转移过程像修复损伤组织那样, 需要正常细胞间、细胞和底物间相互间复杂的作用.已经表征的实例之一是盘基网柄菌形成黏附性, 由特异性细胞表面分子介导的细胞黏附是多细胞发育所必需的.Benoit等(2000)通过控制单个细胞之间的相互作用和结合力谱与遗传操作来量化解离个别细胞黏附分子的去黏附力.此外, Alsteens等(2017b)研究了当病毒与细胞表面受体结合时, 病毒感染的初始阶段. 结合原子力显微镜和共聚焦显微镜配置, 实现了细胞的表面受体扫描成像, 并且以高分辨率展示了在与细胞接触的第一毫秒内的病毒结合事件.提出了病毒和细胞表面受体之间的早期结合事件的自由能量势垒图的理论模拟方法, 发现病毒糖蛋白与其同源细胞表面受体之间形成的第一个键具有相对较低的寿命和自由能, 但随着额外的键快速\(( \leq 1\) ms)形成, 自由能垒增大.附加键的形成发生于正向变构调节, 并且病毒糖蛋白的三个结合位点被快速占据.

5 力谱技术用于原子力显微镜成像

5.1 原子力显微镜成像技术的发展

成像是原子力显微镜应用最多、最广的领域, 绝大多数使用者都会用到这一功能. 在三十年的发展历程中, 已经开发出了十数种原子力显微镜的成像模式. 成像过程中, 大部分情况下需要将探针降落到样品表面, 调整悬臂梁相对于样品的高度以避免针尖和样品间的作用力过大或过小.按照每个像素得到的高度信息扫描整个视野, 便可以得到一个纳米甚至亚纳米级别分辨率的样品形貌信息. 在生物体中, 样品的范围可以从组织片段(Plodinec et al. 2010)、细胞(Friedrichs et al. 2007)、病毒(Kuznetsov & McPherson 2011)、人工或天然膜片(Mari et al. 2011)、各类纤维(Stamov et al. 2015)、水溶性蛋白质(Ido et al. 2014)、膜蛋白(Seelert et al. 2000)、到核酸(Ido et al. 2013, Pyne et al. 2014)等十分广泛.原子力显微镜成像可以用来直接观察细胞的分子机制, 包括ATP合成酶(Uchihashi et al. 2011)、传导通道(Müller et al. 2002)、成孔蛋白(Müller & Engel 1999, Mari et al. 2010)、毒素(Czajkowsky et al. 2004)、质子泵(Shibata et al. 2011)、离子通道(Mari et al. 2011, Rangl et al. 2016)、纤维蛋白(Cisneros et al. 2006)、丝状蛋白(Lehto et al. 2003, Sharma et al. 2014)、细胞外基质蛋白质(Friedrichs et al. 2007)等, 还可以用来观察其生长和重组过程(Gudzenko & Franz 2015). 图18分别以各尺寸的生物样品为例, 展示了原子力显微镜用于生物样品的成像结果.

图18   原子力显微镜用于各尺寸生物样品成像示例. (a)核酸(Pyne et al. 2014); (b)蛋白质(Seelert et al. 2000); (c)纤维(Stamov et al. 2015); (d)病毒(Kuznetsov & McPherson 2011); (e)细胞(Friedrichs et al. 2007); (f)秀丽线虫横截面, 扫描范围24 \(\mu \)m \(\times \) 24 \(\mu \)m \(\times\) 6um (NT-MDT公司)

   

30年来, 原子力显微镜设备本身, 在技术以及方法上也有了重大的革新.很长一段时间内AFM成像中的时间分辨率是相当低的, 限制了其跟踪动态过程的能力. 如今, 关键技术的进步使成像速度得到了显著提高, 衍生出了称为高速AFM的操作模式(Hansma et al. 2006, Ando et al. 2013, Adams et al. 2016).这些进展包括引入具有超短响应时间的小悬臂、更好地抑制机械振动(Sullan et al.2013)、开发快速稳定的压电扫描器, 以及使用在成像期间动态调节反馈增益的控制器等. 如今, 这些改进使得有可能在生理环境中直接观察一系列生理反应的动态过程, 这其中包括分子伴侣(Viani et al. 2000), 细胞骨架运动蛋白(Kodera et al. 2010), 光驱质子泵(Shibata et al. 2011)和酶旋转马达(Uchihashi et al.2011), 胶原纤维发生(Stamov et al. 2015)和酶促降解(Watanabe-Nakayama et al. 2016), 蛋白质在脂膜层中的组装(Karner et al. 2016, Chiaruttini et al. 2015), 蛋白质在活细菌膜层中的组装(Yamashita et al. 2012), 以及核孔复合物的时空动力学(Sakiyama et al. 2016)等.

5.2 基于力谱技术的多参数成像

近年来, 力谱技术与原子力成像模式的组合应用, 使生物样品的多参数成像成为可能(Zhang S et al. 2014).这种组合通常被不同的原子力显微镜厂商命名为不同的模式名称, 各厂商之间的模式一般会在针尖相对样品的运动轨迹, 或者力曲线数据采集和拟合的方式之间存在着细微的差异.但是这些都是基于力--距离曲线, 即原子力显微镜力谱技术的成像模式.这种成像模式的工作原理如图19所示, 针尖在样品表面不断地重复接触-回退的力曲线轨迹, 每个像素点至少记录一条力曲线, 从而通过力曲线直接提取各种机械参数.这些参数中包括样品的弹性、刚度、形变量, 针尖的能量耗散等一系列指标.

图19   原子力显微镜用于各尺寸生物样品成像示例(Dufrêne et al. 2013). (a)探针像对于样品不断进行扫描的同时, 还在往复运动记录力曲线; (b)每个像素点上至少会得到一条力曲线, 通过其直接计算力学相关参数; (c)膜蛋白的形貌图、杨氏模量图、样品形变量图、黏附力图, 标尺为200 nm基于力谱技术的成像已经被应用到多个类型的生物样品, 包括分裂动物细胞的沟槽变硬(Matzke et al. 2001), 各种动物和细菌细胞(Heu et al. 2012, Hecht et al. 2015, Formosa-Dague et al. 2016, Beaussart et al. 2015), 病毒(Marchetti et al.2016), 生物膜和膜蛋白(Medalsy & Müller 2013, Dong et al. 2009, Medalsy et al. 2011).和淀粉样蛋白原纤维(Wegmann et al.2013, Zhang S et al. 2013)等.

   

由于力谱数据本身包含了施加在样品上的作用力的整个过程, 如果对此数据加以利用, 则可以研究在下压和回退过程中样品的完整力学过程, 也就是以受力大小作为第四个维度的成像模式. 如图20所示, 测试了橡胶样品(绿色)在硅基底(紫红色)上受力形变的完整过程.由于每条力曲线都包含了针尖接近样品、接触样品、下压样品、提拉样品、远离样品的整个过程, 则通过重建不同作用力时的三维形貌像, 可以观察样品在不同作用力下的形貌变化过程. 当实验进行时, 操作者设定的是下压的最大值, 此时对应的是图20(c)插图所示的情况, 样品在最大的压力下显示出最低的高度(被压缩), 而通过软件的数据分析功能, 可以重构出刚刚接触图20(a)、压力增加图20(b), 以及压力减小后图20(d)的样品形貌图, 可以看到橡胶样品在外力下的受压形变, 以及区分可以复原的弹性形变区域和无法复原的塑性形变区域.采用这种数据分析方法进行的实验, 测试时只需要扫描一次样品, 通过软件可以抓取各个所需力值对应的形貌结果, 而无需以不同的作用力分别扫描若干次样品, 节省了大量的测试时间.

图20   橡胶样品(绿色)在硅基底(紫红色)上受力形变的完整过程 (NT-MDT公司)

   

5.3 配对样品的高通量表征

与本文第4章的内容类似, 当使用化学基团、配体、受体或病毒功能化的探针进行测量时, 探针会与样品发生特异性相互作用.如果此时使用力谱技术同时结合成像功能, 则能够将这些相互作用的位点映射到样品的形貌图之上.这一技术类型的尝试, 早在21世纪初就已经开始.应用的实例包括探索化学基团、多糖或蛋白质与细胞表面的相互作用结合形貌的研究(Grandbois et al.2000, Dague et al. 2007, Hinterdorfer & Dufrêne2006)等.

通过探测细胞膜表面不同位点配体--受体特异性相互作用, 可以绘制出细胞表面的受体分布图. Osada等(2003)将受体相关蛋白质(RAP)修饰到针尖上, 描绘了RAP连接蛋白在活的Balb 3T3成纤维细胞上的分布.Kim等(2003)用修饰了玻璃黏连蛋白的针尖探测玻璃黏连蛋白受体在活的鼠成骨样细胞MC3T3-E1上的分布, 为了准确定量分析相互作用复合物的数量, 用复合物分离时针尖所做的功(separation work, W, 回缩曲线面积积分)代替断键力值来描述玻璃黏连蛋白与受体的相互作用, 进而通过单分子力谱成像发现小鼠活体成骨细胞上整联蛋白\(\beta\)5分布在细胞脊边缘.此外通过单分子力谱成像探测了仓鼠卵巢细胞上EP3受体的数量, 在面积为5 000 \(\mu \)m\(^{2}\)的细胞表面上大约有1 \(\times\) 10\(^{4}\)个受体(Kim et al. 2006).

功能探针力谱结合成像技术最主要的进步, 是能在检测样品组分变化的同时获取该区域形貌图像, 开辟了应用原子力显微镜在生理条件下研究生物样品结构与功能关系的广阔前景.通过这项技术绘制的受体分布图不如荧光图像直观, 而单独用激光共聚焦显微镜成像受体观察不到细胞的轮廓, 因此如果将两种技术相结合, 则可更清楚地观测受体分布.Park等(2010)通过生物素(biotin)--中性亲和素(neutravidin)的特异性相互作用, 将荧光量子点修饰到海马神经元的络氨酸激酶B (TrkB)上.通过两种技术的结合可以清楚观察到TrkB的分布情况------发现TrkB主要分布在细胞主体区域, 而细胞神经突区域的TrkB 很少. Dupres等(2005)将肝磷脂修饰在针尖上, 研究肝磷脂与分枝杆菌表面肝素结合血凝黏附素(HBHA)的相互作用, 发现HBHA并不是随意分布在分枝杆菌表面, 而是呈纳米簇状分布的. 此外, 通过单分子力谱成像绘制出啤酒酵母细胞上单个Wsc1传感器的分布, 显示出所形成的团簇大小约为200 nm, 并且在应激(渗透压和温度升高)条件下, 团簇明显增加, 直径可达到400 nm以上, 表明了啤酒酵母细胞上功能化蛋白质结构域能够在应激作用下增加(Dupres et al.2009).

这些早期的实验主要受到设备采样率和压电陶瓷性能的限制, 其每条力曲线都需要接近数秒钟的时间完成, 这就大大制约了能够采集的力曲线的数量.由于每个像素至少要有一条力曲线才能计算机械性能, 所以早期的功能探针力谱结合成像技术结果往往像素点都比较少, 且实验时间比较长. 最近五年来, 随着设备性能的提升、新模式的推广, 以及探针相对样品运动轨迹的改良, 商品化设备的力曲线采集频率已经可以提升到2 kHz左右, 使得配对样品的高通量表征成为了现实(见图21).这方面的应用实例包括: 生物膜和膜蛋白的静电性质(Medalsy & Müller 2013, Guo et al. 2016, Pfreundschuh et al. 2013), 被细菌排出的噬菌体(Alsteens et al. 2013a), 结合动物细胞表面受体的包膜病毒(Alsteens et al. 2017b), 结合人G蛋白偶联受体的配体(Alsteens et al. 2015), 两个配体与相同受体的结合(Pfreundschuh et al. 2015), 以及大型蛋白质复合物上配体结合事件的高清成像等(Pfreundschuh et al. 2014, Kim et al. 2015).

图21   配对样品的高通量成像(Alsteens et al. 2015)

   

结合力谱技术的原子力显微镜成像模式在扫描时会记录数十万条力曲线数据, 用以反映机械性能或样品间的相互作用.因此缩短单条力曲线数据的记录时间, 能够减少图像获取时间并动态记录生物学的过程.然而有些配体--受体键合或者化学相互作用在非常快的外力作用下, 是远离平衡态的破坏状态, 此时想要推导其平衡态的力学行为是比较困难的(Evans & Calderwood 2007, Dudko et al. 2008, Friddle et al. 2012).因为在高加载速率下, 必须考虑悬臂梁的流体动力学阻力和物理限制(Amo & Garcia 2016). 所以想要反映这类目标接近平衡态时的相互作用, 需要缓慢地施加外力. 因此, 似乎有可能需要开发能够在非常大的范围选择加载速率的方法, 例如结合当前的超稳定AFM方向(King et al. 2009, Bull et al. 2014, Weafer et al. 2012)与超高速AFM方向(Dong et al. 2011, Rico et al. 2013).

6 展望

原子力显微镜发展至今已有30年的历史, 它的出现对生命科学和生物样品的表征和操纵无疑具有重大影响.在本文中, 我们突出强调了原子力显微镜力谱模式的应用, 其强大的性能可以用于生物系统多参数和多功能的表征.目前力谱技术在微观生物力学领域的应用中, 尚存在着一些缺点和有进步空间的地方, 例如: (1)绝大部分研究均是针对体外培养的细胞进行的, 而实验室环境与体内环境有着巨大的差异(Weiner 2010), 所以在体外培养的细胞与体内细胞很可能有着显著的不同(Yamada & Cukierman 2007). 因此对体外培养的细胞进行研究所得到的结论, 也并不能完全反映生物细胞的真实活动情况.

(2)测试时一次只能测量一个细胞的机械性能, 而这个细胞能否成为众多细胞的代表仍不可控制.所以实验过程中经常选取数个至数十个细胞以取得系列统计结果, 但是单个细胞操作的工作量很大, 导致有限时间内得到的数据有限. 因此, 提高测试效率或联合其他技术有效确定比较典型的细胞需要科学工作者的不懈努力.

(3)采用不同的模型测量细胞的杨氏模量得到的结果差别较大, 因此, 如何统一测量标准是需要解决的实际问题(Moreno-Flores et al. 2010, Guz et al. 2014, Dokukin & Sokolov 2012).

(4)AFM技术的进一步突破还依赖于稳定激光系统的研制、悬臂梁系统的制作、压电换能器材料的探索、光电检测器的改进; 同时也与电子线路、传动马达系统、隔震隔噪声系统的设计与完善密切相关.由于原子力显微镜分辨率和功能与探针性能的密切相关性, 因而探针的制造工艺的提高也是亟待解决的关键问题.目前已经有研究组通过控制温度、悬臂镀层等一系列方法, 来提高AFM测量力值的长期稳定性, 使得AFM 针尖的漂移显著降低(Weafer et al.2012).

(5)原子力显微镜只能获得样品表面信息, 难以获得细胞或菌体等生物体内部分子的特异性信息, 因此需要与其他技术联合使用, 例如激光扫描共聚焦显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、流式细胞仪及分子动力学模拟等(Te Riet et al. 2014, Ramanathan et al. 2015, Franz & Müller 2005 ,Cordes et al. 2010, Monserrate et al. 2014).这将成为原子力显微镜力谱技术的发展趋势.选择时光学显微镜的分辨率应尽可能高, 以便能够更好地将光学图像与不受衍射极限限制的AFM图像相关联.

(6) 虽然力谱技术的基本物理原理很成熟, 但仪器在运行时许多技术问题还有待更多、更深入的理论去解释, 如探针针尖附近的流体力学问题、探针--样品间的力场研究等.这一交叉领域要求研究者对分子生物学、生物化学、生物物理学、表面科学等领域有着广泛的深入了解.

本文叙述了原子力显微镜力谱技术在微观生物力学领域的应用, 回顾了基于原子力显微镜力谱技术的独特能力, 可以对生物样品进行成像、探测、定量测量和操纵等.基于该方法能够以高分辨率对样品进行成像, 并同时映射官能团和结合位点的机械、静电、动力学和热力学等性质.力谱技术能够表征单一受体--配体键, 蛋白质展开和重折叠, 以及肽、核酸、糖和聚合物的机械性质, 也可以使用这些模式来量化对底物、其他细胞或组织的界面的细胞黏附, 增加了在实验中可以获得的数据的多样性和通量. 毫无疑问, 原子力显微镜力谱技术深入地推动和发展了我们对微观生物力学领域的研究方法.

致谢:感谢清华大学微纳米力学中心(CNMM)宋一鸣同学、北京大学生物动态光学成像中心(BIOPIC)莫驰同学对本文的校对.

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


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