力学进展  2018 , 48 (0): 1809- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-007

Orginal Article

软骨组织工程构建中的生物力学

张春秋ɛ, 李可, 高丽兰, 张西正

天津市先进机电系统设计与智能控制重点实验室,天津理工大学机械工程学院,天津 300384

Biomechanics in cartilage tissue engineering

ZHANG Chunqiuɛ, LI Ke, GAO Lilan, ZHANG Xizheng

Tianjin Key Laboratory of the Design and Intelligent Control of the Advanced Mechatronical System, School of Mechanical Engineering, Tianjin University of Technology, Tianjin 300384, China

中图分类号:  R318.01

文献标识码:  A

通讯作者:  ɛ E-mail:zhang chunqiu@126.comɛ E-mail:zhang chunqiu@126.com

收稿日期: 2017-04-1

接受日期:  2017-08-3

网络出版日期:  2017-09-27

版权声明:  2018 中国力学学会 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

基金资助:  国家自然科学基金重点项目(11432016), 国家自然科学基金(11672208, 11572222, 11402171, 11402172)资助

作者简介:

作者简介:张春秋, 男, 天津理工大学机械工程学院教授、博士生导师; 2003年获得吉林大学固体力学博士学位, 2006年于解放军军事医学科学院生物学博士后出站, 2009年于北京航空航天大学生物医学工程博士后出站; 2013年在布朗大学做访问学者. 任中国力学学会生物力学专业委员会委员, 天津市力学学会理事, 天津市力学学会生物力学专业委员会副主任委员; 天津市中青年骨干创新人才, 天津市高校学科领军人才.主要从事生物力学、组织工程生物反应器、固体力学数值方法和应用的研究, 研究方向主要为骨、软骨生物力学; 近年来承担国家级、省部级基金和横向课题10余项, 其中主持国家自然科学基金4项; 在国内外刊物发表学术论文100余篇, 其中SCI、EI收录30余篇; 授权发明专利16项; 2014年获中国人民武装警察部队科学技术进步二等奖.

展开

摘要

关节软骨是关节表面具有弹性的承重组织, 其结构复杂, 由固体相和液体相组成. 固体相包括胶原纤维、蛋白多糖等, 属纤维增强型复合结构; 液体相包括水、电解质等.关节软骨提供了一个低磨损和低摩擦的光滑界面, 起缓冲振动和传递载荷等支撑作用. 由于膝关节承受的运动量大、应力高, 关节软骨损伤在临床上较为常见. 但软骨内没有血管, 代谢缓慢, 其损伤后难以实现自我修复. 组织工程从理论上建立了一种治疗软骨缺损的理想方法, 但尚未成为临床上常规的治疗选择. 如何获得结构和功能相匹配, 同时适用于临床治疗的工程软骨, 至今仍是亟需解决的问题.在体外构建功能化工程软骨, 关键在于运用生物反应器对组织施加合适的力学载荷: 首先保证工程软骨复合体内信号分子、营养和废物的有效运输; 其次对支架内种子细胞产生特定的力学刺激; 同时促进细胞外基质结构与功能的适应性发展.本文对力学载荷在软骨组织工程构建中的应用进展加以综述: 按照作用于组织层面的力学载荷传递所需的介质属性, 将其分为液体介导、固体介导和其他媒质介导三种类型, 重点关注不同载荷对工程软骨功能化构建的作用和效果; 分析讨论软骨组织工程构建中存在的关键生物力学问题; 总结和展望软骨组织工程未来的发展趋势.软骨组织工程体外培养需要考虑力学载荷和生化刺激的耦合作用; 在合适的生化条件下进行滚动、滑动和压缩复合加载, 将有利于工程软骨的体外功能化构建.

关键词: 关节软骨 ; 组织工程 ; 力学载荷 ; 生物力学 ; 力学生物学

Abstract

Articular cartilage is one kind of elastic loaded tissues. Its complex structure contains solid and liquid phases. The solid phase consists of collagens and proteoglycans, and the liquid phase consists of water and electrolyte. The microstructure of the solid phase is a type of fiber reinforced composites. Articular cartilage provides a smooth interface with low wear and friction, and plays an important role in buffering shocks, transferring loading and etc. The knee joint is subjected to a large amount of exercise and high stress, which make the articular cartilage injury common in clinic. Since there is no blood supply in cartilage tissues, they are difficult to heal once injury. Tissue engineering provides an ideal method for the treatment of defects in cartilages. Although cartilage tissue engineering has started to be applied in clinic, but the method is not widely employed. How to get the engineered cartilage, and which structure and function are suitable for the clinical use are still remaining problems to be solved. The key to the construction of functional engineered cartilage in vitro is to apply appropriate mechanical conditions in bioreactors. First, the loads ensure the effective transportation of the internal signals, nutrients and wastes; second, it is necessary to apply specific mechanical stimulations on seed cells in scaffolds; third, it needs to promote the development of the structure and function of extracellular matrix. This paper reviews the latest research in cartilage tissue engineering. This review categorizes the mechanical stimuli into three types according to different medias during the process of load transfer: namely, liquid-mediated forces, solid-mediated forces and other forces. This paper analyzes the major biomechanical problems in cartilage tissue engineering and predicts the trend of future developments. At last, this paper suggests that the synergy of mechanical and biochemical stimuli should be taken into account in cartilage tissue construction. In this way, rolling-sliding-compression load accompanied by appropriate biochemical conditions may be beneficial to realize the functional development of engineered cartilage in vitro.

Keywords: articular cartilage ; tissue engineering ; mechanical stimuli ; biomechanics ; mechanobiology

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张春秋, 李可, 高丽兰, 张西正. 软骨组织工程构建中的生物力学[J]. 力学进展, 2018, 48(0): 1809- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-007

ZHANG Chunqiu, LI Ke, GAO Lilan, ZHANG Xizheng. Biomechanics in cartilage tissue engineering[J]. Advances in Mechanics, 2018, 48(0): 1809- https://doi.org/10.6052/1000-0992-17-007

1 引 言

关节软骨(articular cartilage)仅含少量单一细胞, 其内部没有血液供应, 自愈能力较差, 因此, 如何有效地治疗软骨缺损等疾病成为困扰医学界的难题.关节软骨含有丰富的细胞外基质(extracellular matrix, ECM), 主要包括II型胶原(collagen type II)、蛋白多糖(proteoglycan, PG)和透明质酸(hyaluronic acid)等; 其形态与功能相适应, 呈明显的层状结构, 包括浅表层、中间层、深层和钙化层; 各层胶原纤维的排列和走向、以及细胞和PG的分布都具有随深度变化的结构特征(Grogan et al. 2009, Bernhard & Vunjak-Novakovic 2016). 力学环境的变化会影响生物组织的结构和功能(Dumont & Prakash 2014). Wolff定律指出, 骨的形态和结构受应力变化的影响, 与力学环境相适应. 关节软骨与骨同是人体的承重组织, 也具有结构与功能相适应的特征(Wong & Carter 2003); 同时, 力学刺激是促进关节软骨形成, 保持软骨细胞正常生理表型的重要因素(Responte et al. 2012). 研究表明: 作用在关节软骨上的生理载荷由胶原纤维、PG及液体基质共同承担; 软骨胶原纤维结构的形成与胚胎从发育到成熟的过程中力学环境的变化息息相关(Roddy et al. 2011, Luria & Chu 2014). 在日常运动过程中, 人体关节软骨对复杂的动态载荷具有高度的敏感性, 以确保其能适应周围的环境(O'Conor et al. 2013).

但是, 关节软骨多发生先天性畸形、突发性外伤或退行性病变, 给人体健康造成巨大的影响. 目前, 临床上常采用自体软骨细胞移植(autologous chondrocyte implantation, ACI)技术修复软骨缺损, 疗效较好; 但该方法会造成供体区域损伤或功能退化, 且供体区域有限, 无法修复严重的软骨缺损, 具有极大的局限性(Zhao et al. 2016). 因此, 临床上迫切需要找到更好的治疗方法, 以降低手术的风险和成本, 同时改善治疗的效果和效率. 在此背景下, 在体外构建功能化工程软骨逐渐成为软骨组织工程研究的重要内容. 工程软骨需尽可能地接近天然软骨的特性和功能, 以植入体内替代受损的软骨并恢复其功能. 软骨组织工程理论上可克服现有治疗方法的多种弊端, 被视为临床上修复软骨缺损的理想方法. 由于患者对关节软骨缺损修复的需求日益增长, 长期以来, 软骨组织工程一直都是整个组织工程领域关注的焦点. 但是, 我们至今仍未完全掌握构建可直接用于临床治疗的高质量工程软骨的成熟方法, 软骨缺损修复的长期治疗效果并不令人满意(Bernhard & Vunjak-Novakovic 2016).

生物反应器是施加各类力学载荷和生化刺激的培养装置, 其最终目标是在体外重建体内的生理化学环境, 促进工程软骨组织的生长和发育(Mabvuure et al. 2012). 相关研究和评论指出, 软骨组织工程中种子细胞的选择、支架材料的应用、生化条件的耦合及力学载荷的变化都会影响细胞的基因表达, 影响细胞外基质中胶原和PG的含量(Bastiaansen-Jenniskens et al. 2010, Wu et al. 2011, Shafa et al. 2012, Hoenig et al. 2013, Green et al. 2015, Li et al. 2015, Madeira et al. 2015). 其中, 力学载荷在该过程中产生重要作用; 如果缺少力学刺激, 采用支架材料接种细胞形成的复合体无法获得与天然软骨力学性能接近的、结构与功能相适应的工程软骨.

近年来, 与软骨组织工程构建相关的研究取得了巨大的发展, 哥伦比亚大学生物医学工程系在实验研究中已经获得了力学性能优异的工程软骨(Cigan et al. 2016, Moutos et al. 2016, Ng et al. 2016, Nims et al. 2017). 其中, Nims 等(2017)采用支架接种未成熟牛软骨细胞在限制笼内培养, 获得了力学性能明显改善的工程软骨. Ng等(2016)通过自组装人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells, hBMSCs)培养出层状均匀分布的透明软骨. Cigan 等(2016)在琼脂糖培养基上高密度地接种人软骨细胞, 利用轨道式摇床(orbital shaker)完成培养, 得到的工程软骨具有与天然软骨相接近的力学和生化性能. 另外, Moutos 等(2016)在聚己内酯(polycaprolactone, PCL) 3D纺织支架上接种人脂肪干细胞(human adipose derived stem cells, hADSCs), 在罐式形状的模型中培育出满足人体髋关节尺寸的半球状工程软骨, 适用于全髋关节置换和骨关节炎(osteoarthritis, OA)的治疗, 具有移植后即刻修复关节表面并恢复其力学性能的潜力. 上述工程软骨已具备较高的质量, 具备应用于临床治疗大型软骨缺损的可能性. 但是, 关于影响工程软骨体外构建的不同因素和条件, 特别是哪些力学载荷对工程软骨的培养具有更重要、更有益的影响, 仍存在争议和讨论, 众多学者对此进行了积极地探索和研究.

针对软骨组织工程构建中力学载荷的作用, 本文按照力学载荷在组织层面传递所需的介质属性, 将其分为液体介导、固体介导和其他媒质介导三种类型, 重点关注不同载荷对工程软骨功能化构建的作用和效果; 分析讨论软骨组织工程构建中存在的关键生物力学问题; 总结展望软骨组织工程未来的发展趋势, 并就工程软骨结构功能化构建的发展方向提出观点.

2 软骨组织工程构建中的生物力学

2.1 软骨组织工程生物反应器的特点

力学刺激对关节软骨的组织发育和功能维持, 以及移植软骨和宿主软骨的有效整合具有重要作用(Grad et al. 2011, Theodoropoulos et al. 2016). 例如, 膝关节胫骨和股骨之间相对运动, 使关节软骨主要承受流体剪切、静水压力、压缩、剪切等多种力学载荷; 同时受到不同营养成分、pH值和氧分压等多方面因素的影响(Joseph et al. 2001, Wong & Carter 2003, 张春秋 等 2009, O'Conor et al. 2013). 因此, 设计关节软骨组织工程生物反应器, 应模拟软骨在体的生理环境, 研究软骨组织工程构建中的生物力学问题, 以培养出具有良好的抗压和抗剪能力、结构和功能相适应、形态与天然软骨相类似的功能化软骨组织.

目前, 培养皿和培养瓶仍被广泛地应用于各类实验研究, 为组织生长提供了液体环境和营养物质, 可以说, 它们是最简易的一类生物反应器(Oragui et al. 2011). 随着对关节软骨生物力学特性的认识逐步深入, 各种新型的生物反应器应运而生. 在组织水平上作用于关节软骨的力学载荷种类较多, 相应地, 用于软骨体外构建的生物反应器也有多种不同类型, 如搅拌式、灌流式、旋转壁式、拉伸式、压缩式、液压式、滑动式、滚动式等.

生物反应器可提供不同的力学载荷, 如压缩、拉伸、流体剪切或静水压力等, 每种载荷不同程度地体现着在体软骨的受力状态; 也可提供非接触的物理刺激, 如电场、磁场、微重力、超声波、温度场等; 同时满足适当的pH值、CO\(_{2}\)浓度、氧分压、温度、营养成分和无菌环境等条件.

理想的生物反应器不仅能对工程软骨施加合适的力学载荷, 还应具备研究组织力学生物学响应的监控和检测技术, 通过组织结构的发展和变化确定不同培养条件对细胞行为和状态的影响, 继而优化工程软骨体外构建的方法(Vunjak-Novakovic & Scadden 2011). 要获得理想的工程软骨, 首先需要明确不同力学载荷对软骨组织的作用, 找到合适的力学条件.

2.2 液体介导的力学载荷: 静水压力、流体剪切力或其组合

人体膝关节、髋关节的关节腔内有滑液, 为关节软骨提供必要的营养物质, 同时润滑其表面. 关节软骨含有大量液体基质, 细胞在液态环境下受到流体剪切和静水压力等载荷. 因此, 液体环境是工程软骨构建过程中必不可少的生物力学条件. 生物反应器中合适的水动力条件可以促进软骨细胞ECM中糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)和胶原蛋白的分泌, 改善工程软骨的外观形态和力学性能(Vunjak-Novakovic et al. 1999).

在人行走的过程中, 关节处于反复运动或制动的状态, 关节软骨在此期间承受循环的静水压力, 其生理载荷的峰值是10 \(\sim\) 20 MPa (Hall et al. 1991, JosephSoltz & Ateshian 2000). 特拉华大学Kraft 等(2011)采用高密度的自聚集悬浮培养方法对猪软骨细胞培养物施加静水压力载荷, 显著提高了其胶原蛋白和PG相关的基因的表达; 这种培养方法有利于透明软骨的表型, 产生了类似于天然软骨的组织. 汉堡应用技术大学Heyland 等(2006)和哈佛大学医学院Mizuno

(2011)在研究中分别发现, 循环变化的静水压力在软骨细胞分化的过程中可显著提高牛软骨细胞或猪软骨细胞ECM的合成. 米尼奥大学Correia等(2012)将hADSCs封装于结冷胶(gellan gum)中, 分别提供稳定静水压力和脉冲静水压力; 对照实验表明, 生理载荷下的脉冲压力更有利于软骨细胞的分化和ECM的分泌. 静水压力可均匀地作用在组织各处, 是一种容易应用于工程软骨规模化构建的力学载荷, 但其过于单调的力学刺激无法形成具有层状结构的软骨组织.

关节滑液和细胞间质液的存在不仅对关节软骨产生静水压力, 其流动过程同时产生流体剪切力. 运用图1所示装置, 国立成功大学Tarng等(2012)采用稳定的振荡层流形成振荡剪切应力以及有方向的流体压力来模拟关节的运动, 实验获得的工程软骨在ECM分泌物、细胞分布和力学性能等方面均类似于天然关节软骨. 搅拌刺激可在生物反应器中产生流体剪切力, 促进细胞与支架材料的黏附, 维持软骨细胞的表型(Waldman et al. 2003). 第四军医大学Pei等(2014)设计了一种双腔搅拌式生物反应器培养骨软骨复合体来修复山羊骨软骨缺损; 结果表明, 经过流体剪切力刺激的工程软骨具有更好的修复效果. 旋转壁式生物反应器同样可产生流体剪应力, 为高密度细胞或大体积组织的培养提供了有利条件, 软骨细胞GAG和胶原的分泌量都高于旋转瓶或静态培养; 此外, 在旋转壁式生物反应器中, 营养物质可深入到工程软骨组织内部, 实现较好的传质(Villanueva et al. 2009). 然而, 此生物反应器的培养对象只能是各向同性的组织, 适用于种子细胞的高密度悬浮培养和体外扩增. 如期望培养高质量的工程软骨, 需要叠加其他力学载荷.

图 1   振荡层流叠加水动压力的循环灌注培养装置(Tarng et al. 2012)

   

在功能化软骨组织体外构建生物力学的研究过程中, 需要充分认识各种环境因素间的相互关系并加以运用. 研究软骨组织工程构建, 需要确定不同的培养条件对工程软骨中细胞行为和状态的影响. 汉诺威医学院Petri等(2012)研究了连续灌注和循环压缩载荷对接种在胶原支架上的BMSCs的影响, 发现连续灌注促进细胞增殖, 循环压缩促进细胞分化. 更改相关流体力学参数可以调节工程软骨的生化成分、组织结构和力学性能. 其中, 流体速度的大小、方向以及剪切应力的大小均可影响工程组织的结构和形状, 这些理论可用于指导软骨体外培养模型的构建(Bueno et al. 2009). 莱斯大学Elder和 Athanasiou (2009)在评论中指出, 静水压力可增强工程软骨的生化及力学性能; 生理载荷, 特别是5 \(\sim\) 10 MPa的静水压力有利于改善软骨性能; 间歇加载的生理静水压力可促进MSCs和胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)的分化; 30 \(\sim\) 50 MPa的高压静水压力则抑制细胞的代谢活动, 对软骨细胞产生不利影响. 同时, 上海交通大学Chen等(2017)和慕尼黑大学Schröder等(2016)分别通过实验手段揭示了静水压力对关节软骨体外构建过程可能的调控机制. 此外, 慕尼黑大学Zhu等(2015)比较了灌注条件下静水压力对人软骨细胞基因表达的影响, 发现两者之间具有协同作用, 能促进软骨分化, 同时抑制分解代谢; 采用先灌注, 后加压的加载顺序更有利于软骨细胞的生长. 这说明在软骨组织工程构建过程中时, 各载荷加载的先后顺序将影响工程组织的培养结果.

2.3 固体介导的力学载荷: 压缩

在人体运动过程中, 膝关节两个关节面之间的相对运动使关节软骨产生压缩. 同时, 关节软骨作为关节主要的承重组织之一, 平均承受约0.5 \(\sim\) 7.7 MPa的载荷(Afoke et al. 1987, Mow & Wang 1999, von Eisenhart et al. 1999). 在生理状态下, 关节软骨平均压缩量可达其厚度的13% (Chung & Burdick 2008). 因此, 压缩载荷是软骨组织工程构建及相关生物力学研究中常采用的力学激励形式, 能使工程软骨的杨氏模量、软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)和II型胶原的分泌量显著增加(D\'{e}marteau et al. 2003, Ng et al. 2009). 同时, 有关细胞形变的研究表明: 动态压缩载荷能引起细胞和细胞核变形; 其中, 无侧方物理围限的压缩使细胞出现径向扩张, 产生径向和轴向的拉伸应变, 从而影响和调节干细胞的分化过程(Kuo & Tuan 2008, Connelly et al. 2010, Baker et al. 2011). 总体来说, 压缩载荷对关节软骨体外构建产生积极的正向作用. 在工程软骨体外培养过程中, 动态压缩载荷使软骨出现轴向变形, 引起组织内部的细胞间质液体流动, 造成压力梯度和流动势能的改变.

各类研究针对不同幅值、频率的压缩载荷对软骨组织生长和分化产生的力学生物学影响展开了进一步实验. 麻省理工学院Seidel 等(2004)采用流体灌注和机械压缩载荷组合加载的方式培养工程软骨, 分别改变静态、动态压缩加载的幅值和频率, 然后通过评估工程软骨的结构、成分和性能进一步确定合适的培养条件. 北卡罗来纳州立大学Cashion等(2014)发现, 采用频率为1 Hz的正弦压缩载荷可促进MSCs向软骨组织方向分化, 而频率为100 Hz的正弦压缩载荷则促进MSCs向骨组织方向分化; 低频和高频的压缩刺激产生完全相反的作用, 但诱导干细胞分化形成骨或软骨的压缩频率阈值仍不明确. 俄勒冈健康与科学大学Lujan等(2011)研制的生物反应器可同时对6个培养室中的软骨样本分别产生静态或动态无侧方围限压缩, 压力范围为0.1 \(\sim \) 10 N, 压缩频率范围为1 \(\sim \) 10 Hz, 为研究者提供了一个可精确施加载荷研究工程软骨生物力学特性的平台. 第三军医大学Li等(2014)在pH、氧分压和养分保持平衡、代谢废物及时排出的条件下对接种在脱钙骨基质(decalcified bone matrix, DBM)支架上的大鼠BMSCs细胞进行了21天轴向压缩加载; 实验促进了细胞增殖, 其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性和钙含量均升高; 采用的生物反应器可小范围地调节pH值和氧分压, 实现对组织生理或病理状态的模拟. 天津理工大学Xu 等(2013, 2014)采用音圈电机作为动力源为软骨组织提供高频轴向载荷, 可产生拉伸、压缩、冲压等多种不同形式的力学激励; 加载频率为0 \(\sim\) 200 Hz, 行程为\(\pm 15\) mm. 第三军医大学李殿威等(2010)将兔软骨细胞接种到DBM支架上, 分别在压缩幅度为0 \(\sim \) 5%、0 \(\sim \) 10%和0 \(\sim\) 20%, 频率为0.1 Hz的周期性压力作用下培养; 该实验中, 幅度为0 \(\sim \) 10%的压缩载荷最有利于细胞增殖. 长庚大学Lin W Y等(2014)利用气压对工程软骨进行动态压缩加载; 实验发现, 关节软骨细胞的存活和增殖情况没有显著变化, 但不同压缩频率对细胞的代谢活动产生显著影响; 当压缩频率为2 Hz, 压缩幅度增加到40%时, 细胞的乳酸产量显著高于未加载组.

关节软骨的体外构建是一个长期的、动态的过程. 亚琛工业大学Nebelung 等(2011)对工程软骨样本进行了2周频率为0.3 Hz, 压缩量为10%的连续循环压缩加载; 结果显示, II型胶原的基因表达显著增加; 这说明连续加载的力学载荷有利于工程软骨的形成, 有助于软骨细胞的基因表达和ECM分泌. 类似地, 米尼奥大学Correia 等(2016)对接种于纤维蛋白支架上MSCs样本在压缩量为15%的条件下进行了2周频率为1Hz的动态压缩加载; 实验观察到与ECM分泌相关基因的表达. 综上所述, 无论采用连续压缩还是间歇压缩加载, 其效果并没有显著差异, 均能促进细胞ECM的分泌, 并不同程度地提高工程软骨的力学性能. 压缩加载的频率、幅值和周期对体外构建工程软骨性能的具体影响, 仍有待进一步研究.

为了满足工程软骨组织新陈代谢的需求, 研究人员通常将机械加载和灌流加载系统配合使用. 巴塞尔大学Hoffmann等(2015)发现, 正弦动态压缩载荷与灌注具有协同作用, 可促进软骨组织成熟过程中ECM的矿化. 阿瓦士医科大学Gharravi 等(2012, 2016)将牛鼻软骨细胞接种在海藻酸钠支架上, 利用直接压缩和流体剪切的协同作用促进成熟软骨细胞中GAG和胶原蛋白的合成.

在关节软骨生物力学研究中, 一个能模拟生理条件并提供合适力学载荷的加载系统十分重要. 当人走路时, 骨和关节软骨实际上受到一种低频率高幅值压缩和高频率低幅值压缩相叠加形成的双频载荷; 低频高幅载荷来自大肌肉群的收缩和地面的反作用力; 高频低幅载荷是维持人体姿态的辅助力, 主要来自小肌肉群、韧带和其他组织的牵拉(Fritton et al. 2000, Xie et al. 2006, Reyes et al. 2011). 根据关节软骨所处的力学环境, 天津理工大学Zhang 等(2016)以此为基础设计了一种模拟骨骼和肌肉系统的力学加载模型, 即低频高幅压缩载荷叠加高频低幅压缩载荷的双频加载系统, 如图2所示. 在加载过程中, 每一时刻都有2种不同频率和幅值的压缩载荷复合叠加; 低频率高幅值载荷的范围为1 \(\sim \) 3 Hz和0 \(\sim \) 3 mm; 高频率低幅值载荷的范围为0 \(\sim \) 200 Hz和0 \(\sim\) 60 \(\muup \)m; 实验证明, 软骨在双频载荷条件下的传质速度远高于单频载荷条件. 因此, 动态双频加载提供了一类交变载荷, 即低频高幅叠加高频低幅压缩载荷, 可作为工程软骨体外构建的一种合适的力学环境.

图 2   低频高幅叠加高频低幅压缩载荷的新型双频加载系统

   

此外, 在压缩载荷加载的过程中, 如果压头尺寸小于培养物, 始终保持定点加压有其不足之处. 首先, 培养物径向受压不均匀, 中心高、四周低; 其次, 培养物传质过程不均衡, 中心区域的传质受限制, 不利于营养物质的输送和代谢产物的排出.

天津理工大学张春秋等(2014)提出了一种多位置、点循环加载生物反应器, 能克服上述载荷、传质分布不均的缺点.

2.4 固体介导的力学载荷: 压缩叠加剪切

关节软骨的结构与功能具有适应性, 体现在与周围的力学环境高度适应. 例如, 在人体运动的过程中, 膝关节股骨远端与胫骨近端之间同时存在两种相对运动: 滚动和滑动, 滚动产生压缩, 滑动产生剪切(Joseph et al. 2001, 张春秋 等 2009). 因此, 单独的压缩或者剪切载荷并不能充分提高体外培养关节软骨的力学性能.

目前, 大多数生物反应器所采用的力学载荷往往只涉及一到两个外力, 这对于构建理想的工程软骨明显不足. 瑞士苏黎世Klinik Im Park医院Dr. Stoddart实验室的研究数据表明, 在培养工程软骨时引入压缩和剪切载荷, 可有效改善其力学性能(Stoddart et al. 2006). 此外, 在瑞士AO Research Institute, Dr. Alini的实验室也将表面往复运动和循环压缩载荷叠加应用于各类工程软骨的体外构建(Li et al. 2007). 上述研究成果说明, 滑动和压缩叠加的组合载荷可得到性能较好的工程软骨. 武警后勤学院Sun M和天津理工大学Zhang C等提出假设并设计了滚动压缩加载装置, 如图3, 旨在提供多元力学载荷模拟膝关节的力学环境, 提高体外培养工程软骨的力学性能(Sun et al. 2010, Fan et al. 2011, Gao et al. 2011).

宾夕法尼亚大学Huang等(2012)建立了压头直径、滑动速率和轴向压缩变形量等参数的不同组合, 改变压头与工程软骨的接触面积和应变速率, 模拟不同接触条件下两关节软骨表面间的相对滑动, 并运用该方案对接种在琼脂糖支架上BMSCs细胞进行21天滑动加载; 实验结果显示, 滑动载荷促进了II型胶原的增加和GAG的积累, 可增强工程软骨的抗拉性能. 同样地, 瑞士AO Research Institute的Grad S课题组的实验也表明, 滑动载荷可以调节工程软骨的表面刚度和摩擦系数(Grad et al. 2012).

图 3   滚动、滑动、压缩组合加载装置

   

动态剪切使软骨在水平方向产生变形, 引起组织内部间质液体流动剪切力和压力梯度的变化. 在分别进行动态压缩、剪切加载的基础上, 研究者进一步提出将水平方向和竖直方向的运动进行叠加, 形成动态压缩与动态剪切的组合载荷, 以便更好地模拟关节软骨在体的运动状态和力学环境. 苏黎世联邦理工学院Schätti等(2011)在未添加外源性生长因子的情况下采用表面剪切叠加轴向循环压缩载荷对hBMSCs细胞和聚氨酯复合体进行加载; 结果表明, 单纯的剪切或压缩载荷并不能诱导干细胞向软骨方向分化, 未产生II型胶原; 但应用动态剪切叠加动态压缩刺激则造成干细胞的软骨类基因表达显著增加, 能产生II型胶原. 布朗大学Bilgen等(2013)应用如图4所示的生物反应器对软骨细胞和琼脂糖支架复合体施加双轴正交载荷, 其加载精度可达5 \(\muup \)m; 实验发现, 单轴载荷仅增加工程软骨GAG的沉积; 双轴载荷则同时增加GAG和胶原的沉积. 此外, 其他研究组合载荷加载的团队还有马里兰大学帕克分校Guo (2016)和马来亚大学Yusoff 等(2011). 基于上述研究结果, 本文认为动态压缩载荷在竖直方向上加载, 对应形成关节软骨深层垂直排列的纤维结构; 动态剪切载荷在水平方向上加载, 对应形成关节软骨表层水平排列的纤维结构. 力学载荷的大小、频率及不同载荷的组合会影响细胞行为和组织性能.

图 4   新型双轴正交载荷加载生物反应器(Bilgen et al. 2013)

   

利用生物反应器对工程组织力学生物学响应的在线监控, 可以观察不同力学载荷对工程软骨的影响, 实现软骨体外构建方法的优化. 伦敦大学Di-Federico等(2014)将软骨细胞种植在琼脂糖培养基中并施加双轴载荷, 复合体受到频率为1 Hz的动态压缩叠加剪切载荷刺激; 在48 h的实验周期内, 软骨细胞活性正常, 其结构完整性未发生明显变化; 该加载系统可用于研究工程组织对相关复杂生理刺激的生物力学和力学生物学响应.

2.5 其他媒质介导的力学载荷: 电磁力、微重力、超声波、高加速度等

随着软骨组织工程的飞速发展, 针对关节软骨内细胞所处的复杂生理、力学环境, 许多研究者从探究关节软骨生物力学特性和力学生物学响应的角度出发, 开创性地提出各种施加非接触力学载荷的方法, 如微重力、电磁力、超声波、体外冲击波等, 以期培育结构与功能相一致的工程软骨(Freed & Vunjak-Novakovic 1995, Hsu et al. 2006, Emin et al. 2008).

研究工程软骨可能的力学生物学响应, 是优化其体外模型构建的途径之一. 四川大学Ji和He (2016)提出应用体外冲击波的力学生物学效应培养工程软骨; 体外冲击波可促进生物活性支架和MSCs复合体中细胞的增殖, 同时促进干细胞向软骨方向分化和软骨细胞ECM的合成. 深圳大学、大连理工大学Zhu 等(2017)的实验表明, 在微重力条件下壳聚糖--明胶复合水凝胶支架和hADSCs的复合体内葡萄糖和TGF-\(\beta\)2的传质效率更高; 同时, 微重力能促进复合体内细胞的增殖和软骨向分化.内布拉斯加大学林肯分校Subramanian A课题组开发了研究软骨细胞对超声波的力学生物学响应的生物反应器. 研究指出, 超声波对软骨细胞的增殖、生理表型和基因表达均有积极的正向作用(Subramanian et al. 2013, Guha-Thakurta et al. 2014). 四川大学Wang等(2016)的研究同样表明脉冲超声波可促进大鼠BMSCs向软骨细胞和肥大细胞分化. 上述研究说明, 超声波作为一种特殊的力学载荷, 具有应用于软骨组织工程构建的可能性.

非侵入性的电磁场对软骨再生有积极正向的影响, 临床上广泛应用于骨伤、骨折、缺血性坏死和OA等疾病的治疗. 在软骨缺损治疗过程中, 炎性细胞因子IL-1会抑制干细胞向软骨方向分化, 从而延缓软骨修复; 而费拉拉大学Ongaro等(2015)研究发现电磁场会对上述过程中IL-1的作用产生显著抑制, 从而促进软骨修复. 电磁载荷和机械载荷具有协同作用, 可在一定程度上促进体外工程软骨的构建. 中原大学Tsai 等(2009)发现极低频脉冲电磁场可能在hBMSCs细胞成骨分化的过程中起调控作用. 在随后的另一研究中, 利用如图5所示的加载系统, 慕尼黑工业大学Hilz 等(2014)研究了机械力和电磁力的组合对工程软骨体外培养的影响, 将牛球关节软骨细胞接种到聚氨酯3D支架, 在施加压缩载荷的基础上分别叠加磁通量为1 mT、2 mT、3 mT, 频率为60 Hz正弦电磁场; 实验中3 mT的电磁场与压缩载荷叠加最有利于软骨ECM的合成; 但是, 两种力学刺激的相关性尚不明确, 有待进一步研究. 上述报道说明, 相同或相似的力学载荷对不同种类细胞的调控机制可能完全不同. 此外, 伦敦帝国理工学院Brady 等(2014)发明了高通量磁力与机械压缩组合加载系统, 能同时提供静态或时变磁场以及压缩载荷, 可用来探索电磁加载与机械加载对工程软骨的组合效应.

图 5   极低频低能电磁场叠加机械压缩加载系统(Hilz et al. 2014)

   

此外, 随着航空航天事业的发展, 诸如载人航天器发射与返回、航母舰载机起降等情形会使特定人群长时间暴露在超重力或高加速度等极端力学环境中; 日常生活中, 弹射蹦极、过山车等游乐设施也会使人在短时间内承受高加速度. 在此背景下, 军事医学科学院张西正和天津理工大学张春秋课题组研制了用于研究高加速度环境下骨与软骨组织损伤、适应与重建的力学生物学实验平台(葛洪玉等 2015, Tan et al. 2016). 其中, 葛洪玉等(2015)研制了可供实验室使用的小型旋转式高加速度加载装置, 可实现对培养板或培养瓶内细胞进行0 \(\sim\) \(40g\)的恒加速度或变加速度加载; 利用该装置, 李军等(2017)研究了高重力下前成骨细胞的力学生物学响应. Tan 等(2016)则开发了基于直线电机的直线式高加速度加载平台, 如图6, 可实现0 \(\sim \) \(10g\)的高加速度循环加载, 为直线高加速度条件下骨与软骨的生物力学和力学生物学研究提供了实验装置. 华盛顿州立大学Detzel和 Van-Wie (2011)在离心式生物反应器上接入灌流系统, 可产生持续或间歇的范围在8 \(\sim \) 500 kPa的静水压力; 初步研究表明, 这提供了一种无支架的培养方式, 能减少污染, 适用于工程软骨细胞的高密度培养.

图 6   基于直线电机的直线式高加速度加载平台

   

2.6 软骨组织工程中力学载荷与生化因素的协同作用

当前, 科研工作者们开发了各种类型的生物反应器, 重点研究不同力学载荷对工程软骨构建的作用和影响; 但是, 从工程师的视角, 如果仅考虑力学载荷, 往往会忽略生化因素对软骨生长发育同样具有重要作用. 必要的生化条件是培养工程软骨的基础, 目前同样有大量研究关注于炎症因子、生长因子或其他生化因素对工程软骨构建的影响, 只有充分考虑力学载荷和生化因素的协同作用, 才能找到合适的培养条件.

在人体内, 关节软骨处于低氧环境, 氧含量可能与力学载荷一样对软骨发育和分化产生重要影响. 瑞士AO Research Institute的Wernike 等(2008)在聚氨酯多孔支架上接种牛关节软骨细胞, 分别在常氧(21%)或低氧(5%)条件下培养4周, 每日进行1 h频率为0.5 Hz, 压缩幅度为10% \(\sim\) 20%的循环轴向压缩加载, 低氧组的工程软骨GAG含量更高, 细胞表型更稳定; 该研究表明, 力学载荷结合低氧环境是调节软骨细胞表型的一种有效工具. 此后, 昆士兰科技大学Schrobback 等(2012)研究了氧含量对人关节软骨细胞增殖和分化的影响, 在低氧条件下, 细胞GAG含量和软骨类基因表达显著增加.

生长因子(growth factors, GFs)是刺激细胞生长、促进细胞表型的内源性分子, 包括转化生长因子(transforming growth factor, TGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、血小板衍生因子(platelet derived growth factor, PDGF)等(Tuan et al. 2013). 当培养环境中缺少外源性GFs时, 单纯的力学刺激可能不起作用, 无法引起MSCs细胞的分化(O'Conor et al. 2013). 在软骨组织工程中, 掌握GFs对软骨生长发育的调控机理, 才能更有效地利用GFs的作用. 例如, TGF-\(\beta 1\)可促进静态培养条件下的hBMSCs细胞向软骨细胞分化. 帝国理工学院Albro 等(2016)发现额外添加外源性GFs, 如TGF-\(\beta \), 能促进工程软骨均匀生长, 可用来培养大尺寸的、适用于临床治疗的工程软骨.

阿拉巴马大学伯明翰分校Carmona-Moran和Wick (2015) 将hBMSCs细胞接种在PCL支架, 加入TGF-\(\beta 1\)后对复合体表面施加流体剪切载荷, 测试其对软骨细胞表型的影响, 发现流体剪切和TGF-\(\beta 1 \)的协同作用可促进细胞增殖和GAG生产, 同时促进其分化为软骨. 华盛顿州立大学Nazempour 等(2016)发现振荡流体压力和TGF-\(\beta 3 \)产生协同作用, 可提高工程软骨的杨氏模量, 改善其力学性能. 此外, 静水压力与GFs的配合在软骨体外构建过程中同样具有协同作用, 经过优化的静水压力、外源性GFs与机械力学载荷的组合有利于功能化软骨组织的构建(Elder & Athanasiou 2009).

软骨疾病的产生和发展是分解代谢和合成代谢之间复杂的相互作用的结果(Pohlig et al. 2016). 营养物质和代谢产物的变化, 如葡萄糖、维生素等营养物质的消耗和乳酸等代谢产物的累积, 也会影响软骨细胞的生长、分化和凋亡. 日本东北大学Omata等(2012)研究了在加入维生素C的情况下压缩载荷对牛软骨细胞再生软骨力学特性的影响; 该实验表明, 力学载荷可促进再生软骨内部营养物质的扩散, 提高软骨细胞合成ECM的能力, 有利于大型软骨缺损的修复. 在此特别指出, 特温特大学Spitters等(2013)发明了一种能实现营养物质、生长因子和生长因子受体拮抗剂呈梯度变化分布的生物反应器, 为研究工程软骨新陈代谢过程提供了新的实验模型.

在工程软骨体外培养过程中, 氧分压、CO\(_{2}\)浓度、生长因子、营养物质与代谢产物、温度、酸碱环境等各种生化因素的变化都会造成培养条件的改变, 进而影响软骨体外构建的结果. 例如, 牛津大学Khan和Surrao (2012)发现酸性环境能抑制软骨细胞增殖和ECM合成, 碱性环境则促进软骨细胞增殖和ECM合成. 同时, 各因素之间往往不是单独作用, 而是相互联系, 相互影响, 共同作用于工程软骨. 因此, 在软骨组织工程体外构建过程中需要充分考虑各因素之间的关系, 包括力学载荷和生化刺激之间的协同作用或拮抗作用, 以提供更好的培养条件.

3 讨论

如前文所述, 软骨的生长、发育和维持正常功能都需要生理载荷的刺激.在体外构建功能化软骨组织, 需要生物反应器施加力学载荷; 同时, 生物反应器亦可用来测试不同培养条件对软骨组织的影响, 探索OA等疾病的发病机制, 测试新药物疗效等(Lin H et al. 2014).

世界上许多科研机构都在从事软骨组织工程构建的相关研究, 主要集中在美国、中国、德国、瑞士和英国. 由于培养目的、培养材料和培养方式不同, 使用的大多数生物反应器都是定制的, 缺乏统一标准, 培养装置的设计理念和关键参数均不同; 同时, 各研究选择的细胞种类、来源不同, 培养液的成分不同, 支架材料不同, 使得各实验的结果和结论之间很难直接进行比较. 因此, 软骨组织工程构建生物力学的研究及培养装置的设计制造应逐步向动态化、模块化和标准化发展. 例如, 汉堡应用技术大学Goepfert等(2013)提出一种关于模块化生物反应器的概念. 天津理工大学Wang D S等(2013)设计了基于直线电机的组合式多功能生物反应器, 如图7, 由动态拉伸、压缩、剪切、滚动、滑动、双频加载等多个模块组成. 本文涉及的相关研究目的不同, 施加载荷的侧重点不同, 产生的效果也不同, 部分实验的结果和结论之间仍存在矛盾和争议. 尽管如此, 整体而言, 适当的、合理的力学载荷有助于功能化工程软骨的生长发育.

就本文所述的软骨组织工程构建研究而言, 所施加的力学载荷都只在部分程度上模拟了人体关节的力学环境. 今后应深入探究每种单独的力学载荷对关节软骨的作用机理, 在此基础上确定一种有代表性的、综合的力学条件对工程软骨进行复合加载. 合适的力学条件应主要满足以下几方面要求: 第一, 在物理围限条件下培养. 当工程软骨被移植到体内填补宿主软骨的缺损区域时, 其侧面和底面与宿主软骨之间相互接触形成约束; 受到载荷作用后, 工程软骨侧向的膨胀和变形受到限制; 在设计工程软骨体外培养的支架或模具时, 应考虑提供物理围限约束. 第二, 力学加载模式的灵活性. 目前, 软骨组织工程体外构建多是有计划地在固定时间段为工程软骨施加特定的力学载荷; 这种加载模式可能带来工程软骨的记忆效应, 对实验结果造成一定影响和偏差; 在体关节软骨所受的力学载荷每时每刻都随着机体生长、代谢和运动的情况变化; 在软骨组织工程体外构建力学加载模式的设计上应考虑这种变化, 如通过实验或监测方法采集人体运动中的相关力学数据并应用到工程软骨培养过程中.

第三, 载荷形式的多样性. 在体关节软骨长期处于复杂的力学和生理环境, 存在多种力学载荷的动态组合, 目前用于软骨组织工程的加载装置大多仅提供一种或两种力学载荷, 在载荷形式的多样性方面不足以反映实际的力学环境; 例如, 拉夫堡大学Hussein等(2015)在设计生物反应器时考虑了三轴加载的组合, 可进一步丰富工程软骨体外构建中力学加载形式的多样性. 第四, 生化因素的介入. 通过加入多种抗氧化因子、抗炎因子、营养物质、生长因子等, 在培养过程中尽可能地接近甚至优化在体的生理环境, 以达到持续培养工程软骨的目的.

图 7   基于直线电机的组合式多功能生物反应器, 可组装拉伸、压缩、剪切、滚动、滑动等多种加载模块

   

关节软骨所处力学环境复杂, 其不同层的结构形态和力学特性与环境相适应. 弗莱堡大学Wang N等(2013, 2014)认为, 体外培养时先让组织自由膨胀, 再施加力学载荷更有利于工程软骨的形成.

软骨组织工程的体外构建需要进一步将理论分析和实验研究的结果相结合, 找到合适的力学条件: 该条件首先能保证营养供应和废物排出, 满足组织代谢和传质的要求; 同时能模拟关节运动过程, 对工程软骨施加必要的力学载荷和生化刺激, 实现其结构与功能的适应性.

在物理围限的约束下, 滚动、滑动和压缩复合加载可产生多种力学载荷的组合效应, 结合生化条件的协同作用, 将有利于工程软骨的代谢和传质, 可能是关节软骨结构和功能适应性构建的发展方向.

近年来, 软骨组织工程构建的主要方法是选择种子细胞种植在支架上, 然后通过生物反应器施加力学载荷和生化刺激, 经过一定周期的培养, 最终获得工程软骨. 这一过程中仍存在一些需要解决的问题: 如何在加载装置中复制在体的生理环境; 如何保证最有效、最稳定的软骨细胞表型和ECM分泌; 如何避免因污染造成不必要的损失和失败; 如何促进工程软骨和宿主软骨的有效整合, 防止产生退化等; 这也是软骨组织工程构建的研究发展方向. 巴塞尔大学医学院Tonnarelli等(2016)设计了一种软骨组织工程流水化生产方法, 将细胞接种、扩增和分化置于同一个装置, 能减少培养过程的污染, 降低培养成本. 奥塔哥大学Schon等(2017)描绘了应用模块化组装技术来构建高质量工程软骨的前景. 由于实验模型和测量技术的局限性, 部分在体的数据很难直接通过实验获取, 因此, 利用计算机模型完成数值模拟成为一种预测关节软骨受力后位移、应力和应变的变化, 评估材料特性, 以及模拟损伤演化、传质、组织生长和缺损修复等过程的有效方法. 利用计算仿真的结果可以更好地指导生物反应器的研发以及组织工程软骨的培养(Raimondi et al. 2011, Zhang et al. 2014, Iannetti et al. 2016, Qiu et al. 2016). 此外, 确定关节软骨的细观力学特性, 描述软骨不同层区的黏弹性规律也是软骨组织工程研究的必要基础, 天津理工大学Zhang 和Gao 课题组对关节软骨受载后的力学行为展开了一系列实验和模拟研究, 取得了一定进展(Gao et al. 2012, 2013, 2014, 2015; Zhang et al. 2012; Qiu et al. 2016).

成熟关节软骨所承受的力学载荷主要由胶原纤维、GAG及液体基质共同承担; 其软骨细胞的含量极少, 对关节软骨承力结构的影响有限. 关节软骨的主要成分之一是II型胶原, 胶原本身具有自聚集效应, 在力学载荷作用下可产生定向排列的密集纤维结构. 哈佛大学医学院Saeidi等(2009, 2011)发现剪切载荷能诱导胶原纤维高度定向排列. 普渡大学Cheng 等(2008)则通过施加电流刺激获得了高度定向、密集排列且机械性能优良的胶原纤维束.

上述研究说明, 作为天然软骨承受力学载荷的主要载体之一, 胶原蛋白在适当力学条件下可定向排列并密集分布, 形成纤维结构, 提升组织的力学性能. 实验证明, 在胶原纤维束的形成过程中, 改变胶原蛋白和聚集剂浓度、力学条件、流速、温度或pH值等参数, 可以大幅改善纤维形态和强度(Paten et al. 2013). 不妨假设, 在体外培养胶原蛋白和凝胶的复合体, 添加适当活性物质和GFs并提供必需的生理环境, 在特定力学载荷作用下, 可构建类似天然软骨结构的工程组织; 将获得的工程软骨移植到体内, 利用生物体本身作为天然的生物反应器, 实现组织的进一步发育和成熟, 达到修复软骨缺损和治疗疾病的目的. 在蓬勃发展的生物3D打印技术支撑下, 利用胶原蛋白作为原材料制造自组装的工程软骨是可能的, 这将会是一个具有潜力的研究领域.

4 结论和展望

关节软骨本身没有神经支配, 也没有血管, 其营养成分只能从关节液中获取, 而其代谢产物也必须排至关节液中. 关节软骨的新陈代谢必须通过关节运动实现, 使关节软骨不断地受到力学载荷, 完成物质交换, 供应营养并排出废物. 软骨组织工程中关键之一在于找到合适的力学载荷; 首先要满足组织代谢和传质的要求; 其次又能模拟关节运动, 对软骨产生适当的、耦合的力学载荷和生化刺激, 促进工程软骨的功能化构建. 在体关节软骨受到复杂的载荷, 压缩、拉伸、剪切、流体剪切或静水压力都仅部分程度地体现其受力状态; 同时, 生化因素对软骨组织的生长发育也具有重要作用. 因此, 只有通盘考虑力学载荷和生化因素的协同或拮抗作用, 才能得到合适的培养工程软骨的条件. 在合适的生化条件下实施滚动、滑动和压缩复合加载可能有利于工程软骨的代谢和传质, 促进工程软骨的功能化构建.

生物反应器已广泛应用于软骨组织工程构建. 随着临床研究不断深入, 对软骨疾病的诊断和治疗, 正逐渐结合患者的具体病情向个性化精准治疗方向发展. 这要求工程软骨的体外培养应逐步实现个人定制. 工程软骨结构和性能的测试逐步实现精细化和无损化, 如利用超声波或磁共振方法实现在线的宿主软骨和工程软骨结构分析和性能测试(Crowe et al. 2011, Mansour et al. 2014, Chung et al. 2015). 医工结合已成为软骨组织工程的发展趋势, 既要开展生物力学和力学生物学领域的基础研究, 获得力学载荷调控软骨组织生长和分化的机制; 又要从工程学角度出发, 将相关机制灵活应用在生物反应器设计和工程软骨培养过程中(Huey et al. 2012, Madry et al. 2013, Nukavarapu & Dorcemus 2013, Parker et al. 2013, Cucchiarini et al. 2014, O'Conor et al. 2014, Caldwell & Wang 2015, Makris et al. 2015, Rotherham & El-Haj 2015, Vonk et al. 2015, Huynh et al. 2017). 这需要来自生物医学、临床医学和工程学领域的深入合作, 让软骨组织工程构建逐步从实验室研究应用到商业化生产, 投入临床治疗, 使工程软骨移植成为治疗关节软骨缺损等疾病的常规手段.

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。


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